丹參、川芎對正常人及硬皮病成纖維細胞松弛素受體LGR7表達的影響.pdf

1、[目的] 觀察中藥丹參和川芎嗪對正常人及硬皮病患者皮損的成纖維細胞增殖的影響，并觀察松弛素受體在正常人及硬皮病患者成纖維細胞表達的變化及中藥丹參和川芎嗪對松弛素受體表達的影響，從而探究中藥抑制成纖維細胞增殖的機制及松弛素受體在抗纖維化作用中能否作為藥物作用的靶點． [方法] 1成纖維細胞培養(yǎng)無菌條件下，將組織塊放入DMEM培養(yǎng)液中漂洗，剪成1mm×1mm大小的組織塊，將組織塊均勻涂布于培養(yǎng)瓶壁，加入20％胎牛血清

2、的DMEM培養(yǎng)液，每隔2-3天更換培養(yǎng)液。7-14d可見組織塊周圍有成纖維細胞萌出，約20天成纖維細胞接近80％鋪滿培養(yǎng)瓶表面時，按1：2比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)，每3d～4d傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗。 2．MTT測定成纖維細胞增殖將對數生長期的成纖維細胞以10％DMEM培養(yǎng)液調整成1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180μL細胞懸液，24h后細胞已貼壁，分別加入藥物，并設空白對照組。在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培

3、養(yǎng)48h后，每孔加入5mg/mLMTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO150μL/孔，震蕩10min，用酶標儀檢測492nm處的吸光度值(OD值)。 3．成纖維細胞免疫組化采用免疫組化S—P法，按免疫組化試劑盒說明書工作流程操作，實驗設陰性對照(用PBS代替LGR7)。 4．流式細胞儀將對數生長期的成纖維細胞以10％DMEM培養(yǎng)液調整成1×104/mL，。取100mL培養(yǎng)瓶，每瓶加入細胞懸液10mL(1×105個細胞

4、/瓶)，預培養(yǎng)48h。按實驗分組加入含藥培養(yǎng)基后，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。制備成細胞懸液，加入4％多聚甲醛固定，離心去除固定液，加入3mLPBS洗兩遍，加入松弛素受體一抗，37℃孵育1小時，加入3mLPBS洗兩遍，加入FITC標記二抗，37℃孵育30分鐘，避光保存，上流式細胞儀檢測。 5．采用SPSS11.0、3統(tǒng)計軟件包，數據均以均數±標準差(x—±S)表示，組間計數資料用t檢驗。 [結果] 1．丹參在10mg/m

5、L以上對正常人和硬皮病患者成纖維細胞增殖有抑制作用；川芎嗪在0．5mg/mL以上時對正常人和硬皮病患者成纖維細胞增殖有抑制作用，達到5．0mg/mL則能完全抑制成纖維細胞的增殖。 2．LGR7在正常人成纖維細胞胞漿及胞膜呈棕黃色，判讀為陽性。LGR7在硬皮病患者成纖維細胞胞漿及胞膜無棕黃色染色，判讀為陰性。 3．中藥丹參和川芎嗪均有降低正常人和硬皮病患者成纖維細胞上LGR7的表達數量和表達強度的趨勢[結論]丹參和川芎嗪達