丹參、川芎對(duì)正常人及硬皮病成纖維細(xì)胞松弛素受體LGR7表達(dá)的影響.pdf

1、[目的] 觀察中藥丹參和川芎嗪對(duì)正常人及硬皮病患者皮損的成纖維細(xì)胞增殖的影響，并觀察松弛素受體在正常人及硬皮病患者成纖維細(xì)胞表達(dá)的變化及中藥丹參和川芎嗪對(duì)松弛素受體表達(dá)的影響，從而探究中藥抑制成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制及松弛素受體在抗纖維化作用中能否作為藥物作用的靶點(diǎn)． [方法] 1成纖維細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下，將組織塊放入DMEM培養(yǎng)液中漂洗，剪成1mm×1mm大小的組織塊，將組織塊均勻涂布于培養(yǎng)瓶壁，加入20％胎牛血清

2、的DMEM培養(yǎng)液，每隔2-3天更換培養(yǎng)液。7-14d可見(jiàn)組織塊周?chē)谐衫w維細(xì)胞萌出，約20天成纖維細(xì)胞接近80％鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶表面時(shí)，按1：2比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)，每3d～4d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2．MTT測(cè)定成纖維細(xì)胞增殖將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞以10％DMEM培養(yǎng)液調(diào)整成1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180μL細(xì)胞懸液，24h后細(xì)胞已貼壁，分別加入藥物，并設(shè)空白對(duì)照組。在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培

3、養(yǎng)48h后，每孔加入5mg/mLMTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO150μL/孔，震蕩10min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)492nm處的吸光度值(OD值)。 3．成纖維細(xì)胞免疫組化采用免疫組化S—P法，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)工作流程操作，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照(用PBS代替LGR7)。 4．流式細(xì)胞儀將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞以10％DMEM培養(yǎng)液調(diào)整成1×104/mL，。取100mL培養(yǎng)瓶，每瓶加入細(xì)胞懸液10mL(1×105個(gè)細(xì)胞

4、/瓶)，預(yù)培養(yǎng)48h。按實(shí)驗(yàn)分組加入含藥培養(yǎng)基后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。制備成細(xì)胞懸液，加入4％多聚甲醛固定，離心去除固定液，加入3mLPBS洗兩遍，加入松弛素受體一抗，37℃孵育1小時(shí)，加入3mLPBS洗兩遍，加入FITC標(biāo)記二抗，37℃孵育30分鐘，避光保存，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 5．采用SPSS11.0、3統(tǒng)計(jì)軟件包，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±S)表示，組間計(jì)數(shù)資料用t檢驗(yàn)。 [結(jié)果] 1．丹參在10mg/m

5、L以上對(duì)正常人和硬皮病患者成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用；川芎嗪在0．5mg/mL以上時(shí)對(duì)正常人和硬皮病患者成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用，達(dá)到5．0mg/mL則能完全抑制成纖維細(xì)胞的增殖。 2．LGR7在正常人成纖維細(xì)胞胞漿及胞膜呈棕黃色，判讀為陽(yáng)性。LGR7在硬皮病患者成纖維細(xì)胞胞漿及胞膜無(wú)棕黃色染色，判讀為陰性。 3．中藥丹參和川芎嗪均有降低正常人和硬皮病患者成纖維細(xì)胞上LGR7的表達(dá)數(shù)量和表達(dá)強(qiáng)度的趨勢(shì)[結(jié)論]丹參和川芎嗪達(dá)