小鼠生發(fā)泡完整卵母細(xì)胞中母源基因克隆、定位和功能.pdf

1、目的:伴隨卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的是核糖體和mRNAs轉(zhuǎn)錄活化,小鼠大約在排卵前6天,卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和分化結(jié)束而達(dá)到成熟,此時(shí)卵母細(xì)胞中合成和積累了多種RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,這些構(gòu)成了早期胚胎發(fā)育的母源物質(zhì).胚胎發(fā)育從受精開始,新受精卵中就存儲(chǔ)大量的母源物質(zhì),隨著胚胎進(jìn)一步發(fā)育,母源mRNAs逐漸消耗,必然需要合子基因組的適時(shí)表達(dá)并完全取代之,以實(shí)現(xiàn)由母型向合子型調(diào)控過渡,缺乏合子基因組激活的動(dòng)物胚胎無法進(jìn)一步發(fā)育.已有研究表明,小鼠合子基因組激

2、活發(fā)生于1-細(xì)胞晚期,從未受精卵到單細(xì)胞胚胎是母源物質(zhì)控制,由母源物質(zhì)支持并指導(dǎo)了早期胚胎發(fā)育直到合子基因組激活.因此,母源物質(zhì)對(duì)早期胚胎發(fā)育的作用日益受到重視,但對(duì)早期胚胎發(fā)育或?qū)β涯讣?xì)胞向合子過渡有影響的作用的母源基因極少被克隆或識(shí)別.方法:21、應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH),以生發(fā)泡完整的卵母細(xì)胞為檢測(cè)子(Tester),8-細(xì)胞胚胎為驅(qū)趕子(Driver),建立GV卵母源基因的消減cDNA文庫(kù).通過斑點(diǎn)雜交法進(jìn)一步篩選GV卵中

3、母源基因的消減cDNA文庫(kù),對(duì)陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和同源性分析;并隨機(jī)選取3個(gè)克隆,以其cDNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR方法對(duì)SSH的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.2、根據(jù)小鼠Peroxiredoxin Ⅱ mRNA序列(Accession No:BC002034)設(shè)計(jì)引物,對(duì)小鼠生發(fā)泡完整卵母細(xì)胞(GerminalVesicle intact oocyte,GV卵)中的Peroxiredoxin Ⅱ可能編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增.另外取小鼠的卵巢,石

4、蠟包埋切片,分別應(yīng)用原位雜交方法和免疫組織化學(xué)染色觀察Peroxiredoxin Ⅱ mRNA和蛋白在卵巢各級(jí)卵泡中的分布.同時(shí),運(yùn)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察Peroxiredoxin Ⅱ在植入前胚胎的表達(dá).3、收集昆明白小鼠的單細(xì)胞受精卵,采用微滴培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)48h,觀察Peroxiredoxin Ⅱ抗體對(duì)胚胎發(fā)育的影響.應(yīng)用共聚焦掃描顯微鏡術(shù)結(jié)合特異性熒光探針2','二氯熒光黃雙乙酸酯,觀測(cè)Peroxiredoxin

5、 Ⅱ抗體對(duì)小鼠胚胎中活性氧自由基水平的影響.結(jié)論:1、應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù),我們成功建立小鼠GV卵中母源基因的消減cDNA文庫(kù),為我們進(jìn)一步研究母源基因在卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ).2、Peroxiredoxin Ⅱ mRNA是母源性遺傳信息,小鼠卵巢內(nèi)Peroxiredoxin Ⅱ mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯始于初級(jí)卵泡中的卵母4細(xì)胞,并持續(xù)到近成熟卵泡.Peroxiredoxin蛋白是母源性蛋白,植入前胚胎中的Perox