綿羊CTSB基因克隆及其活性與卵母細(xì)胞發(fā)育能力相關(guān)性研究.pdf

1、組織蛋白酶B(CTSB)是重要的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，在多種生理及病理活動(dòng)中發(fā)揮作用，對(duì)動(dòng)物的卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育能力有著重要影響。研究綿羊卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中CTSB活性的變化規(guī)律及其與卵母細(xì)胞發(fā)育能力的相關(guān)性，可為提高綿羊體外胚胎生產(chǎn)效率提供理論依據(jù)和技術(shù)措施。
　　 本研究克隆得到了綿羊CTSB基因的CDS序列，全長(zhǎng)1008bp，編碼335個(gè)氨基酸，已提交至Genbank（登錄號(hào):KC699918）。利用多種生物信息

2、學(xué)軟件預(yù)測(cè)綿羊CTSB蛋白質(zhì)具有典型的木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征，由信號(hào)肽、前體肽及成熟肽構(gòu)成，具有Cys108、His278和Asn298三個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)，以及CTSB蛋白特有的閉合環(huán)(occludingloop)結(jié)構(gòu)，并存在翻譯后磷酸化及糖基化修飾。
　　 利用熒光底物法使用酶標(biāo)儀檢測(cè)綿羊卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)在體外成熟過(guò)程中CTSB活性變化規(guī)律，結(jié)果表明:綿羊COCs中CTSB活性隨著體外成熟時(shí)

3、間的延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)，成年綿羊中，與IVM0h時(shí)COCs中CTSB活性相對(duì)熒光單位(RFU)比值(1.0000)相比較，IVM8h時(shí)降至0.7740(P＜0.05)，IVM16h降至0.7030(P＜0.01)，IVM24h降至0.3709(P＜0.01)。羔綿羊中，與IVM0hRFU比值(1.0228)相比較，IVM8h(1.0267)未有顯著變化(P＞0.05)，IVM16h降至0.7817(P＜0.01)，IVM24h降至0.6

4、087(P＜0.01)。IVM8h及IVM24h羔綿羊COCs中CTSB活性顯著高于成年綿羊。使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)成年綿羊卵母細(xì)胞及卵丘細(xì)胞中CTSB活性光密度平均值，結(jié)果顯示IVM24h的卵母細(xì)胞中CTSB活性(0.0046)極顯著低于IVM0h(0.0119)(P＜0.01)，卵丘細(xì)胞中CTSB活性(0.2175)則顯著低于IVM0h(0.2960)(P＜0.05);質(zhì)量差的COCs經(jīng)體外成熟24h之后，卵母細(xì)胞及其卵丘細(xì)胞

5、中CTSB活性光密度平均值（0.0439和0.4371）均極顯著提高于正常質(zhì)量組(P＜0.01)。
　　 在成熟液中添加不同濃度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64，研究其抑制CTSB活性及其與卵母細(xì)胞發(fā)育能力相關(guān)性的結(jié)果表明:成年綿羊1μmol/LE-64組在IVM8h時(shí)COCs中CTSB活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，5μmol/L及10mol/LE-64組則極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，IVM16h各試驗(yàn)組均極顯著低于對(duì)

6、照組(P＜0.01)，IVM24h均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，羔綿羊5μmol/LE-64組各時(shí)間點(diǎn)CTSB活性均極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);成年綿羊COCs在含有1，5，10μmol/LE-64的成熟液中經(jīng)24h體外成熟，E-64各濃度組卵母細(xì)胞中CTSB活性較對(duì)照組并未顯著降低(P＞0.05)，但卵丘細(xì)胞中CTSB活性則顯著降低(P＜0.05);1，5，10μmol/LE-64對(duì)成年綿羊卵母細(xì)胞成熟率及卵裂率無(wú)顯著影響(