小鼠第一極體重組卵母細胞研究.pdf

1、哺乳動物的卵母細胞在減數(shù)分裂過程中產生的第一極體(The first Polar Body,以下簡稱PbI)和第二極體(The second Polar Body,下簡稱PblI)在正常情況下并不參與胚胎的發(fā)育而逐漸退化。因此許多學者誤認為極體是完全沒有功能的小細胞。然而，F(xiàn)eng等 (1997)，Wakayama等(1997、1998)的研究結果證實：將PbI注入去核卵母細胞后再注入精子頭部可以產生具有生殖功能的小鼠后代。同時，國內學

2、者對這一問題也開始逐漸有所認識，但至今仍沒有確切的研究結果報道。確立此課題的目的是通過驗證和評價PbI的生殖功能潛力，為進一步開展其他動物卵母細胞PbI相關研究奠定理論與技術基礎。 本研究以昆明系和ICR系小鼠為研究對象，首先通過人為干預其排卵時間的手段解決如何得到數(shù)量充足和具有高生物活性PbI的問題；再通過生物化學的方法從卵母細胞中分離出PbI，進而對其進行保存條件研究。并采用細胞工程手段將獲得的PbI染色體組重組入卵母細胞

3、中，觀察其是否具有生殖功能。 1、小鼠第一極體的獲取及保存條件研究 用孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)對6～8周齡的雌性昆明系及ICR系小鼠進行超數(shù)排卵處理，從注射hCG后10h起每隔2h采集一組小鼠的卵丘卵母細胞復合體(COCs)，對卵母細胞內的PbI的數(shù)量和形態(tài)進行統(tǒng)計，并用臺盼藍染色法鑒定第一極體的活性；同時對新獲取的卵丘卵母細胞復合體進行不同溫度條件的保存實驗。結果表明，在注射hCO后12-14

4、h所獲得卵母細胞內的PbI活性最高；在室溫和37℃下，卵丘卵母細胞復合體內的PbI活性很快便完全喪失，而在4℃條件下保存，經過48h后其活性依然良好。 2、小鼠卵母細胞與PbI的分離 將包含有PbI的卵母細胞移入鏈霉蛋白酶溶液中在室溫(25℃)下作用30s，然后迅速移入M2液中，用直徑150-200 μm的玻璃微管反復柔和吹吸卵母細胞，直到透明帶完全破裂，PbI即可與卵細胞完全分離，然后再將單個的PbI拾獲，放入微滴培養(yǎng)

5、系統(tǒng)中培養(yǎng)。 3、PbI重組卵母細胞研究 利用顯微操作技術將昆明系小鼠PbI的內容物取出并迅速注射入經去核處理的同種卵母細胞中，在M2培養(yǎng)液中培養(yǎng)2h后使其與精子發(fā)生體外受精作用，然后再轉入M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察發(fā)育狀況。同時用C57BL／6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FMl310sb系小鼠和C57BL／6J系小鼠為參照實施同樣的操作流程進行驗證。結果昆明系小鼠117枚重組卵母細胞中有13枚發(fā)育到2-細