小鼠第一極體重組卵母細(xì)胞研究.pdf

1、哺乳動物的卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生的第一極體(The first Polar Body,以下簡稱PbI)和第二極體(The second Polar Body,下簡稱PblI)在正常情況下并不參與胚胎的發(fā)育而逐漸退化。因此許多學(xué)者誤認(rèn)為極體是完全沒有功能的小細(xì)胞。然而，F(xiàn)eng等 (1997)，Wakayama等(1997、1998)的研究結(jié)果證實：將PbI注入去核卵母細(xì)胞后再注入精子頭部可以產(chǎn)生具有生殖功能的小鼠后代。同時，國內(nèi)學(xué)

2、者對這一問題也開始逐漸有所認(rèn)識，但至今仍沒有確切的研究結(jié)果報道。確立此課題的目的是通過驗證和評價PbI的生殖功能潛力，為進(jìn)一步開展其他動物卵母細(xì)胞PbI相關(guān)研究奠定理論與技術(shù)基礎(chǔ)。 本研究以昆明系和ICR系小鼠為研究對象，首先通過人為干預(yù)其排卵時間的手段解決如何得到數(shù)量充足和具有高生物活性PbI的問題；再通過生物化學(xué)的方法從卵母細(xì)胞中分離出PbI，進(jìn)而對其進(jìn)行保存條件研究。并采用細(xì)胞工程手段將獲得的PbI染色體組重組入卵母細(xì)胞

3、中，觀察其是否具有生殖功能。 1、小鼠第一極體的獲取及保存條件研究 用孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)對6～8周齡的雌性昆明系及ICR系小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵處理，從注射hCG后10h起每隔2h采集一組小鼠的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，對卵母細(xì)胞內(nèi)的PbI的數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計，并用臺盼藍(lán)染色法鑒定第一極體的活性；同時對新獲取的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行不同溫度條件的保存實驗。結(jié)果表明，在注射hCO后12-14

4、h所獲得卵母細(xì)胞內(nèi)的PbI活性最高；在室溫和37℃下，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體內(nèi)的PbI活性很快便完全喪失，而在4℃條件下保存，經(jīng)過48h后其活性依然良好。 2、小鼠卵母細(xì)胞與PbI的分離 將包含有PbI的卵母細(xì)胞移入鏈霉蛋白酶溶液中在室溫(25℃)下作用30s，然后迅速移入M2液中，用直徑150-200 μm的玻璃微管反復(fù)柔和吹吸卵母細(xì)胞，直到透明帶完全破裂，PbI即可與卵細(xì)胞完全分離，然后再將單個的PbI拾獲，放入微滴培養(yǎng)

5、系統(tǒng)中培養(yǎng)。 3、PbI重組卵母細(xì)胞研究 利用顯微操作技術(shù)將昆明系小鼠PbI的內(nèi)容物取出并迅速注射入經(jīng)去核處理的同種卵母細(xì)胞中，在M2培養(yǎng)液中培養(yǎng)2h后使其與精子發(fā)生體外受精作用，然后再轉(zhuǎn)入M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察發(fā)育狀況。同時用C57BL／6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FMl310sb系小鼠和C57BL／6J系小鼠為參照實施同樣的操作流程進(jìn)行驗證。結(jié)果昆明系小鼠117枚重組卵母細(xì)胞中有13枚發(fā)育到2-細(xì)