小鼠18S rRNA基因在卵巢和卵母細胞中的表達及其RNAi載體構建.pdf

1、目的:檢測小鼠18S rRNA基因在卵巢及單個GV期、M Ⅰ期卵母細胞中的表達，揭示核糖體18S rRNA基因與小鼠卵母細胞成熟之間的關系。分析小鼠18S rRNA生物信息學數(shù)據(jù)，設計并構建其RNA干擾載體，為研究其在早期胚胎發(fā)育中的作用奠定基礎。 方法:根據(jù)Genbank中已公布的小鼠18S rRNA保守區(qū)核酸序列(363bp)，用DNAclub軟件設計兩對特異性引物，RT-PCR分別檢測卵巢和單個GV期、M Ⅰ期卵母細胞18

2、s rRNA的表達；將單個M Ⅰ期卵母細胞中獲得的目的片段連接至pTG19-T載體、轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞后，篩選陽性克隆進行測序，用RNAdraw、VECTOR NIT 9.0、ClutalX 1.81、Treeview等軟件對測序結果進行生物信息學分析；同時用載體表達法構建18S rRNA干擾載體。 結果:①通過RT-PCR檢測顯示18s rRNA基因在小鼠卵巢組織和單個GV期、M Ⅰ期卵母細胞中均有表達，且在未成熟卵母細

3、胞中，M Ⅰ期的表達明顯強于GV期的表達； ②RT-PCR產(chǎn)物克隆測序結果顯示：昆明小鼠18s rRNA基因保守區(qū)序列與基因庫序列[MR＿003278保守區(qū)部分(791bp～1153bp)]完全一致；Blastn比對結果發(fā)現(xiàn)：在不同物種中差異較小，選出14種生物18S rRNA全序列經(jīng)VECTOR NIT 9.0軟件分析，提示昆明小鼠18S rRNA與牛、人類、刺猬、中國倉鼠、豬、犰狳、褐鼠、兔子、馬、食蟹猴、負鼠、短尾猊、袋熊

4、的18S rRNA的相似率依次為67％，100％，100％，36％，100％，100％，67％，100％，100％，92％，99％，99％，99％；Clustal 1.81和Treeview構建出的分子進化樹表明:在上述14種生物中昆明小鼠與中國倉鼠進化關系最近，與兔子、豬聚成一簇，與食蟹猴進化關系最遠；③根據(jù)18S rRNA二級結構設計并合成RNA干擾寡核苷酸片段，重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶及測序表明成功構建了pGPH1/GFP/Neo

5、-mouse-sh 18S rRNA干擾表達質(zhì)粒。 結論:①小鼠18s rRNA在卵巢及未成熟卵母細胞中均有表達，且在M Ⅰ期的卵母細胞中表達明顯強于GV期的卵母細胞，提示小鼠M Ⅰ期之后的卵母細胞發(fā)育需要蛋白質(zhì)的合成，卵母細胞的成熟可能與核糖體18S基因表達有關；②質(zhì)粒測序結果與基因庫序列兩兩比對顯示：小鼠18S rRNA基因保守區(qū)變異小，在進化上是非常保守的；③14種生物分子進化樹分析結果反映了小鼠18S rRNA基因與中國