小鼠卵母細胞干細胞體外分離、建系及其功能研究.pdf

1、最近，在小鼠和人的卵巢中發(fā)現(xiàn)卵母細胞干細胞，挑戰(zhàn)了長達半個多世紀的卵巢生物學中心法則，即:雌性哺乳動物出生后，其卵巢所儲存的卵泡數(shù)量是固定的，不再產(chǎn)生新的卵泡。這一生殖生物學新發(fā)現(xiàn)迫使我們重新認識卵泡的發(fā)生和卵巢的功能。但是，從首次報道分離卵母細胞干細胞后，至今沒有見到進一步的有關卵母細胞干細胞的報道，而且，后續(xù)的報道與以前的報道也不完全一致。因此，在該研究中，我們首先按照發(fā)表的方法分離小鼠的卵母細胞干細胞，在此基礎上，我們優(yōu)化了小鼠卵

2、母細胞干細胞分離的方法，并對建立的卵母細胞干細胞進行各種鑒定和分析。
　　在本實驗中，我們首先采用磁珠分選方法從出生2周齡左右的乳鼠卵巢內(nèi)分離、純化表達細胞表面有DDX4蛋白的卵巢細胞，分離純化后獲得細胞系4株，將其中的兩株在體外培養(yǎng)傳代30代以上，染色體核型分析顯示細胞系無染色體丟失，染色體條數(shù)為40條(38+XX)。4株細胞系堿性磷酸酶染色均呈陽性，但是，隨著細胞代數(shù)增加，堿性磷酸酶染色變淺，在第9代后，堿性磷酸酶的染色基本穩(wěn)

3、定。細胞免疫熒光染色證明這類細胞均表達Oct4、DDX4、C-kit、Nanog等生殖干細胞標記蛋白，采用RT-PCR基因表達分析進一步證明這些細胞的確表達有Oct4、DDX4、C-kit、Blimp1、Ifitm3等生殖干細胞標志基因。在本研究中我們簡化了分離卵母細胞干細胞方法，采用了連續(xù)貼壁法首先富集了卵母細胞干細胞，簡化了整個實驗過程，提高了分離方法的重復性。經(jīng)體外和體內(nèi)實驗手段對卵母細胞干細胞的發(fā)育潛能進行分析和鑒定，我們成功在