護骨素與2型糖尿病血管并發(fā)癥的研究.pdf

1、研究背景：2型糖尿病的發(fā)病率逐年增加，已經成為嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。2型糖尿病的主要危害是糖尿病所致的各種嚴重慢性并發(fā)癥，包括大血管并發(fā)癥，如冠心病、腦梗塞、外周動脈硬化等，以及微血管并發(fā)癥，如糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病和神經病變等。防治糖尿病所致的大血管及微血管并發(fā)癥是糖尿病領域的主要任務，但糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制目前仍不清楚。非酶蛋白糖化、多元醇通道途徑激活、氧化應激、炎性反應及免疫因素等是糖尿病慢性并發(fā)癥的可能發(fā)

2、病機制之一，但上述因素并不能解釋糖尿病慢性并發(fā)癥的全部機制。是否還存在其它機制仍是目前糖尿病研究領域的重要課題之一。護骨素（osteoprotegerin，OPG）是1997年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族新成員，它的主要生物學作用是抑制破骨細胞形成、分化、存活并誘導其凋亡，對于骨代謝有重要意義。近來研究發(fā)現(xiàn)，OPG亦是一重要的血管調節(jié)因子，與動脈粥樣硬化和血管鈣化相關聯(lián)，可能在血管疾病

3、的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調節(jié)作用。國外許多學者研究了血清OPG水平與冠心病及外周動脈粥樣硬化的關系，結果發(fā)現(xiàn)血清OPG水平不僅與冠心病、動脈粥樣硬化的存在顯著相關，而且與其嚴重程度有明顯關系，高血清OPG水平是發(fā)生冠心病和心血管疾病的獨立危險因素。糖尿病的慢性并發(fā)癥主要是大血管和微血管并發(fā)癥，是否OPG與糖尿病的慢性并發(fā)癥有關？關于此方面的研究國內未見報道，國外的報道亦較少，部分研究結果表明，糖尿病并冠心病患者或糖尿病并微血管病變患者的血

4、清OPG水平升高，因此OPG可能與糖尿病的慢性血管并發(fā)癥有關。本課題主要系統(tǒng)研究OPG與2型糖尿病血管并發(fā)癥的關系，為糖尿病并發(fā)癥的研究提供新的思路。 目的：第一部分：應用ELISA法檢測2型糖尿病并大血管病變患者的血清OPG水平，同時應用PCR-RELP測定OPG950T-C基因多態(tài)性。以其探討（1）血清OPG水平與2型糖尿病并大血管病變的關系。（2）2型糖尿病并大血管病變患者血清OPG水平與FPG、2hPG、HbA1c、血脂

5、、胰島素抵抗及hsCRP等指標的關系，進一步研究糖尿病并大血管病變的相關危險因素。（3）OPG950T-C基因多態(tài)性是否與糖尿病大血管病變有關。通過以上研究了解OPG在糖尿病大血管并發(fā)癥中的作用及意義。第二部分：應用ELISA法測定2型糖尿病并腎病患者的血清OPG水平，同時對部分糖尿病腎病患者行腎活檢，應用免疫組化技術檢測OPG在糖尿病腎組織中的表達。以其探討（1）血清OPG與2型糖尿病腎病及其嚴重程度的關系。（2）OPG在腎組織中的表

6、達與糖尿病腎病及其嚴重程度的關系。（3）糖尿病腎病患者血清OPG水平與血糖控制、炎性指標、血脂、胰島素抵抗等指標的相關性，進一步研究糖尿病腎病的相關危險因素。第三部分：應用ELISA法測定2型糖尿病并視網膜病變患者的血清OPG水平。以其探討：（1）血清OPG水平與糖尿病視網膜病變及其嚴重程度的關系。（2）糖尿病視網膜病變患者的相關危險因素以及與血清OPG水平的關系。 材料與方法： 第一部分： 1.病例選擇：200

7、6年3月至2008年9月在山東省濰坊醫(yī)學院附屬青州醫(yī)院內分泌科、心內科和神經內科住院和門診的2型糖尿病患者168例。根據有無大血管病變分為大血管病變組86例和無大血管病變組82例。另選擇年齡、性別相匹配的40例健康者為對照組。 2.標本留取：所有個體空腹12h后次晨抽靜脈血，進行生化指標的測定。采取靜脈血，分離血清后-70℃保存，集中測定血OPG水平。抽取靜脈血肝素抗凝，-70℃保存，集中行OPG基因多態(tài)性的測定。 3.

8、試驗方法 （1）血清OPG水平應用ELISA法測定。血糖采用葡萄糖氧化酶法測定。利用化學發(fā)光法測定空腹胰島素（Fins）。胰島素抵抗指數(shù)采用穩(wěn)態(tài)模式評估法（HOMA-IR）計算。HbA1c采用NycoCard ReaderⅡ金標定量檢測儀測定。hsCRP采用免疫比濁法測定。血脂指標應用全自動生化分析儀測定。 （2）OPG950T-C基因多態(tài)性的測定：①DNA的提?。阂锏脑O計：上游序列：5’-CCCAGGGGCCAGAC

9、ACCAC-3’，下游序列：5’-GCGCGCAGCACAGCAACTT-3’，目的片段長度330bp。②PCR擴增：PCR反應體系：模板2ul；10×PCR Buffer5ul；25mM MgCL24ul；4×dNTP1ul；上游引物P10.5ul；下游引物P20.5ul； Taq酶2U；超純水36ul；液體石蠟30ul。PCR反應結束后，取10μl反應產物于1.2％瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，紫外線透射儀上觀察結果，拍照或掃描保存。

10、③PCR產物的酶切：應用HincⅡ限制性內切酶對PCR產物進行酶切，HincⅡ限制性內切酶酶切反應體系：PCR產物15μl；10×buffer2μl； HincⅡ1.5μl；超純水1.5μl。37℃水浴反應4h，取10μl于1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 4.統(tǒng)計學處理：結果以x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，比較有差異者進行兩兩比較。各變量之間的關系用spearman相關分析，多因素相關分析采用Logistic回歸分析。統(tǒng)計

11、軟件為SPSS12.0。 第二部分： 1.病例選擇：2006年3月至2008年9月在山東省濰坊醫(yī)學院附屬青州醫(yī)院內分泌科、腎內科住院和門診的2型糖尿病患者110例。根據24h尿白蛋白排泄率（UAER），分為正常白蛋白尿組38例，微量白蛋白尿組36例，大量白蛋白尿組36例。另選擇年齡、性別相匹配的40例健康者為對照組。 2.標本留?。核袀€體空腹12h后次晨抽靜脈血，進行生化指標的測定。采取靜脈血，分離血清后-70

12、℃保存，集中測定血OPG水平。所有患者留取24小時尿，記錄尿量，混勻后取2 ml送檢測定尿微量白蛋白。腎活檢標本的采集：微量蛋白尿及大量蛋白尿組的部分患者經病人及家屬同意，簽訂腎活檢協(xié)議書。局麻、B超引導下，應用腎活檢針，采集腎組織2-4條，石蠟包埋，切片行HE染色和免疫組化檢查。 3.試驗方法 （1）血清OPG水平應用ELISA法測定。血糖采用葡萄糖氧化酶法測定。利用化學發(fā)光法測定空腹胰島素。胰島素抵抗指數(shù)采用HOMA

13、-IR計算。HbA1c和尿微量白蛋白采用NycoCard ReaderⅡ金標定量檢測儀測定。hsCRP采用免疫比濁法測定。血脂指標應用全自動生化分析儀測定。 （2）腎活檢組織OPG免疫組化染色：采用即用型免疫組化染色試劑盒，一抗：兔抗人OPG多克隆抗體；二抗：親和純化抗體，山羊抗兔IgG。結果判定以染色呈棕黃色顆粒為陽性表達，染色結果根據陽性細胞顯色深淺及陽性細胞百分率分級分別進行評分，根據相加得分判定表達強弱。 4.統(tǒng)

14、計學處理：結果以x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，比較有差異者進行兩兩比較。各變量之間的關系用spearman相關分析，多因素相關分析采用多元回歸分析。統(tǒng)計軟件為SPSS12.0。 第三部分： 1.病例選擇：2006年3月至2008年9月在山東省濰坊醫(yī)學院附屬青州醫(yī)院內分泌科、眼科住院和門診的2型糖尿病患者98例。根據有無眼底視網膜病變分為無眼底病變組38例，背景期視網膜病變組30例和增殖期視網膜病變組30例。

15、 2.標本的留取與檢測：所有個體空腹12h后次晨抽靜脈血，進行生化指標的測定。采取靜脈血，分離血清后-70℃保存，集中測定血OPG水平。血清OPG水平應用ELISA法測定。其它血清指標的檢測同第一部分。 3.統(tǒng)計學處理：結果以x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，比較有差異者進行兩兩比較。各變量之間的關系用spearman相關分析，多因素相關分析采用Logistic回歸分析。 結論： 1.2型糖尿病并大血管病變

16、、并腎病、并眼底視網膜病變患者血清護骨素水平顯著高于無并發(fā)癥者，且與嚴重程度有關；血清OPG水平是糖尿病血管病變的獨立影響因素，說明血清OPG水平與糖尿病血管并發(fā)癥有關，OPG在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中可能起一定作用，血清OPG水平升高可作為糖尿病血管病變的標志物。 2.2型糖尿病并血管并發(fā)癥患者血清護骨素水平與FPG、2hPG、HbA1C、HOMA-IR、hsCRP呈明顯正相關，表明血清護骨素水平的升高與血糖控制、胰島素