SARS冠狀病毒S蛋白表位的篩選、診斷抗原的制備和免疫活性研究.pdf

1、目的：分析篩選SARS冠狀病毒(SARSassociatedcoronavirus，SARS-CoV)S蛋白的抗原表位，分別采用人工合成抗原肽和基因表達方法獲取抗原蛋白并對其免疫原性和免疫反應(yīng)性進行分析，為診斷SARS-CoV的早期感染、排查疑似病例和大規(guī)模流行病學調(diào)查的檢測試劑盒的制備奠定實驗基礎(chǔ)。 方法：通過生物信息學方法分析SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白，用多參數(shù)預(yù)測其B細胞表位，從S蛋白中篩選出保守、特異的表位，在S1和S

2、2蛋白部分各合成一段均為28aa的多肽(peptide1和peptide2)；同時合成S1部分一段801bp(304aa～571aa)的基因片段克隆到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍白篩選挑取陽性重組子pUCm-T/SARS-S1進行限制性內(nèi)切酶酶切、PCR及測序鑒定，并對測序結(jié)果用Blast軟件進行分析。pUCm-T/SARS-S1經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ雙酶切，回收酶切目的片段并定向克隆至原核細胞表達載體pET

3、-28b(+)，PCR、雙酶切和通用引物測序鑒定。重組子pET-28b/SARS-S1轉(zhuǎn)化E.coliril后，以1mMIPTG誘導(dǎo)表達，并用SDS-PAGE和Westernblot鑒定表達產(chǎn)物(rSARS-S1)，經(jīng)三種方法洗滌包涵體后，采用Ni-NTASpinkit對沉淀中的融合蛋白在變性條件下進行純化，用急性期或恢復(fù)期SARS-CoV患者血清檢測產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性。將獲得的抗原免疫新西蘭兔制備其相應(yīng)多克隆抗體并純化，用ELISA和W

4、esternblot鑒定其識別peptide1、SARS-S1表達蛋白、SARS-CoV及其裂解產(chǎn)物的特異性。 結(jié)果：人工合成了兩段多肽并制備了其多克隆抗體(分別命名為Ab1、Ab2)；將合成的801bp的S1部分核苷酸插入pUCm-T克隆載體，經(jīng)核酸序列測定分析，與GeneBank公布的序列完全一致；回收酶切目的片段S1并定向克隆至原核細胞表達載體pET-28b(+)，pET-28b/SARS-S1經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切

5、酶切鑒定表明，插入序列與PCR擴增序列相符；pET-28b/SARS-S1轉(zhuǎn)化E.coliril，用IPTG誘導(dǎo)表達，37℃下5h達到最高的表達量(47％)，主要為包涵體形式存在的32kD的目的蛋白(rSARS-S1)，與預(yù)期蛋白大小一致，Westernblot鑒定其為帶組氨酸標簽(6-His)的融合蛋白：經(jīng)三種方法洗滌包涵體，得到純度大于90％的rSARS-S1，經(jīng)Ni-NTASpinKit鎳離子親和純化獲得了大于95％的純化蛋白rS

6、ARS-S1；ELISA試驗證明其能與合成肽peptide1的抗體Ab1反應(yīng)，而與peptide2的抗體Ab2不能結(jié)合；rSARS-S1能與急性期或恢復(fù)期SARS-CoV患者血清反應(yīng)，而合成肽不能；rSARS-S1的免疫血清能與peptide1和rSARS-S1反應(yīng)，效價均在1：640以上。 結(jié)論：成功構(gòu)建了SARS-S1基因片段的原核表達載體pET-28b/SARS-S1，并在E.coliril中高效表達出相對分子量約為32k