多疣壁虎GFAP基因的克隆及其脊髓橫斷損傷后GFAP的表達(dá)變化.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最廣泛的一類(lèi)細(xì)胞，也是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種。創(chuàng)傷、缺血、感染、中毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）自身免疫性疾病等各種因素造成的CNS 損傷中，皆可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，以GFAP的急劇上調(diào)為其特點(diǎn)，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大、遷移至病灶并最終形成膠質(zhì)瘢痕。GFAP—星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，因而被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中標(biāo)記反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的敏感且可靠的指標(biāo)。
　　 脊髓損傷可

2、導(dǎo)致神經(jīng)通路中斷、神經(jīng)元受損和繼發(fā)性脊髓損傷。由于神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的特殊性以及損傷導(dǎo)致的一系列病理變化，使得脊髓再生和功能恢復(fù)非常困難。各國(guó)神經(jīng)科學(xué)家正在努力不懈地攻克這一醫(yī)學(xué)上的難題，以造福人類(lèi)。目前對(duì)于脊髓橫斷性損傷的修復(fù)仍有大量研究需要探究。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是中樞神經(jīng)組織損傷后的修補(bǔ)愈合反應(yīng)，可通過(guò)細(xì)胞間的緊密連接和縫隙連接相互交織成網(wǎng)狀而形成瘢痕組織，但瘢痕組織也抑制了CNS 損傷后軸突的再生。
　　 由于壁虎等低等脊

3、椎動(dòng)物脊髓損傷后具有再生能力，因此探討高等脊椎動(dòng)物脊髓再生的一個(gè)可行性的思路就是通過(guò)研究具有脊髓再生能力的低等動(dòng)物脊髓再生的現(xiàn)象，深入了解其允許脊髓再生的內(nèi)在機(jī)制，為高等動(dòng)物脊髓再生提供有價(jià)值的線(xiàn)索。研究報(bào)道，壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量稀少。這是否提示在壁虎脊髓再生中星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)可能較弱呢？這是一個(gè)非常有趣的科學(xué)問(wèn)題且至目前尚無(wú)人報(bào)導(dǎo)證實(shí)。而以往的研究也表明，在哺乳動(dòng)物及人類(lèi)，脊髓損傷后伴有強(qiáng)烈的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，并認(rèn)為這是阻礙脊髓再生的原因

4、之一。因此，探討壁虎脊髓橫斷損傷后反應(yīng)和再生的獨(dú)特機(jī)制對(duì)研究高等哺乳動(dòng)物乃至人類(lèi)的脊髓再生都有更直接的啟示作用，而利用壁虎建立一個(gè)穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)的脊髓損傷模型，是研究其脊髓再生機(jī)理的必要前提。
　　 為了探明星形膠質(zhì)細(xì)胞與壁虎脊髓損傷和再生的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以GFAP 作為壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，采用基因克隆、實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot、免疫熒光組織化學(xué)法等方法，研究壁虎脊髓橫斷損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)狀況。為揭

5、示壁虎脊髓橫斷損傷后反應(yīng)和再生的獨(dú)特機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為人類(lèi)脊髓損傷康復(fù)治療啟迪思路。第一部分多疣壁虎GFAP基因的克隆及其抗體制備由于目前尚無(wú)有關(guān)壁虎GFAP基因的研究報(bào)道和商品化的壁虎GFAP 抗血清，因此本部分實(shí)驗(yàn)擬克隆多疣壁虎GFAP基因，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析；自制針對(duì)壁虎GFAP蛋白的特異性抗體。為后續(xù)研究壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓損傷再生的關(guān)系提供必要的研究工具。
　　 首先從南通醫(yī)學(xué)院已建立的壁虎cDNA 文庫(kù)當(dāng)中挑取

6、了GFAP基因序列，但其并不完整（缺5'端），于是我們采用快速cDNA 末端擴(kuò)增（RACE）實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增其5'末端，并與文庫(kù)序列拼接從而得到了壁虎GFAP mRNA的全長(zhǎng)序列；通過(guò)Northern Blot 試驗(yàn)驗(yàn)證壁虎GFAP基因的組織表達(dá)；并通過(guò)免疫兔子產(chǎn)生針對(duì)壁虎GFAP的抗體血清，采用ELISA法測(cè)定其抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，壁虎GFAP mRNA 全長(zhǎng)為1770bp，編碼446個(gè)氨基酸，分子量估計(jì)為52 kD；生物學(xué)分析顯示在已知物種

7、GFAP 當(dāng)中其與紅原雞同源性最高；組織表達(dá)譜顯示其主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦和脊髓）；成功構(gòu)建壁虎GFAP 原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1-gGFAP；成功免疫動(dòng)物產(chǎn)生了GFAP多克隆抗體，ELISA測(cè)定血清效價(jià)為1：10000，并且能與壁虎脊髓組織GFAP 抗原發(fā)生反應(yīng)，其稀釋度可至1：500。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)首次成功克隆了壁虎GFAP mRNA 全長(zhǎng)基因，并獲知其生物學(xué)性狀；構(gòu)建了其原核表達(dá)載體；并成功制備了針對(duì)壁虎GFAP的多克隆

8、抗體，為后續(xù)研究壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓損傷再生的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分多疣壁虎脊髓橫斷損傷后GFAP的表達(dá)變化
　　 為了研究多疣壁虎脊髓橫斷損傷后GFAP的表達(dá)變化，探討壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓再生能力的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并實(shí)施壁虎脊髓橫斷損傷模型，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot 方法檢測(cè)GFAP mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化；采用免疫熒光組織化學(xué)法觀(guān)察增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞其形態(tài)及數(shù)量的變化。結(jié)果顯示

9、，在壁虎脊髓橫斷損傷后GFAP 在基因和蛋白的水平上反應(yīng)類(lèi)似，即損傷后1天表達(dá)即有微量上調(diào),3天到達(dá)小高峰，隨后開(kāi)始下降，在2周時(shí)接近正常水平；免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示：在脊髓損傷后GFAP 在灰質(zhì)區(qū)無(wú)明顯增殖，在脊髓白質(zhì)區(qū)的腹側(cè)和兩側(cè)，顯示為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、突起增多，但通過(guò)對(duì)脊髓損傷截面L10以下2 mm 脊髓段連續(xù)切片的細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性增加。結(jié)果提示，多疣壁虎脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)在時(shí)間和空

10、間上具有局限性，與哺乳類(lèi)和人類(lèi)脊髓損傷后強(qiáng)烈的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)截然不同，這種獨(dú)特的局限性可能有利于壁虎脊髓損傷后的再生。
　　 小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)首次成功克隆了壁虎GFAP mRNA 全長(zhǎng)基因，獲知其生物學(xué)性狀，應(yīng)用GST 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了壁虎GFAP 原核表達(dá)載體并進(jìn)行體外表達(dá)。通過(guò)壁虎原核表達(dá)的GFAP 免疫兔，制備了GFAP多克隆抗血清。為后續(xù)研究壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓損傷再生的關(guān)系提供了研究工具。本研究還表明，壁虎G