多疣壁虎GFAP基因的克隆及其脊髓橫斷損傷后GFAP的表達(dá)變化.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞，也是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種。創(chuàng)傷、缺血、感染、中毒、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）自身免疫性疾病等各種因素造成的CNS 損傷中，皆可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，以GFAP的急劇上調(diào)為其特點，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞增生肥大、遷移至病灶并最終形成膠質(zhì)瘢痕。GFAP—星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，因而被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中標(biāo)記反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的敏感且可靠的指標(biāo)。
　　 脊髓損傷可

2、導(dǎo)致神經(jīng)通路中斷、神經(jīng)元受損和繼發(fā)性脊髓損傷。由于神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的特殊性以及損傷導(dǎo)致的一系列病理變化，使得脊髓再生和功能恢復(fù)非常困難。各國神經(jīng)科學(xué)家正在努力不懈地攻克這一醫(yī)學(xué)上的難題，以造福人類。目前對于脊髓橫斷性損傷的修復(fù)仍有大量研究需要探究。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是中樞神經(jīng)組織損傷后的修補愈合反應(yīng)，可通過細(xì)胞間的緊密連接和縫隙連接相互交織成網(wǎng)狀而形成瘢痕組織，但瘢痕組織也抑制了CNS 損傷后軸突的再生。
　　 由于壁虎等低等脊

3、椎動物脊髓損傷后具有再生能力，因此探討高等脊椎動物脊髓再生的一個可行性的思路就是通過研究具有脊髓再生能力的低等動物脊髓再生的現(xiàn)象，深入了解其允許脊髓再生的內(nèi)在機制，為高等動物脊髓再生提供有價值的線索。研究報道，壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量稀少。這是否提示在壁虎脊髓再生中星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)可能較弱呢？這是一個非常有趣的科學(xué)問題且至目前尚無人報導(dǎo)證實。而以往的研究也表明，在哺乳動物及人類，脊髓損傷后伴有強烈的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，并認(rèn)為這是阻礙脊髓再生的原因

4、之一。因此，探討壁虎脊髓橫斷損傷后反應(yīng)和再生的獨特機制對研究高等哺乳動物乃至人類的脊髓再生都有更直接的啟示作用，而利用壁虎建立一個穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強的脊髓損傷模型，是研究其脊髓再生機理的必要前提。
　　 為了探明星形膠質(zhì)細(xì)胞與壁虎脊髓損傷和再生的關(guān)系，本實驗以GFAP 作為壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，采用基因克隆、實時定量PCR、Western Blot、免疫熒光組織化學(xué)法等方法，研究壁虎脊髓橫斷損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)狀況。為揭

5、示壁虎脊髓橫斷損傷后反應(yīng)和再生的獨特機制提供實驗依據(jù)。為人類脊髓損傷康復(fù)治療啟迪思路。第一部分多疣壁虎GFAP基因的克隆及其抗體制備由于目前尚無有關(guān)壁虎GFAP基因的研究報道和商品化的壁虎GFAP 抗血清，因此本部分實驗擬克隆多疣壁虎GFAP基因，并對其進行生物學(xué)分析；自制針對壁虎GFAP蛋白的特異性抗體。為后續(xù)研究壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓損傷再生的關(guān)系提供必要的研究工具。
　　 首先從南通醫(yī)學(xué)院已建立的壁虎cDNA 文庫當(dāng)中挑取

6、了GFAP基因序列，但其并不完整（缺5'端），于是我們采用快速cDNA 末端擴增（RACE）實驗擴增其5'末端，并與文庫序列拼接從而得到了壁虎GFAP mRNA的全長序列；通過Northern Blot 試驗驗證壁虎GFAP基因的組織表達(dá)；并通過免疫兔子產(chǎn)生針對壁虎GFAP的抗體血清，采用ELISA法測定其抗體效價。結(jié)果顯示，壁虎GFAP mRNA 全長為1770bp，編碼446個氨基酸，分子量估計為52 kD；生物學(xué)分析顯示在已知物種

7、GFAP 當(dāng)中其與紅原雞同源性最高；組織表達(dá)譜顯示其主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦和脊髓）；成功構(gòu)建壁虎GFAP 原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T1-gGFAP；成功免疫動物產(chǎn)生了GFAP多克隆抗體，ELISA測定血清效價為1：10000，并且能與壁虎脊髓組織GFAP 抗原發(fā)生反應(yīng)，其稀釋度可至1：500。結(jié)果表明，本實驗首次成功克隆了壁虎GFAP mRNA 全長基因，并獲知其生物學(xué)性狀；構(gòu)建了其原核表達(dá)載體；并成功制備了針對壁虎GFAP的多克隆

8、抗體，為后續(xù)研究壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓損傷再生的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分多疣壁虎脊髓橫斷損傷后GFAP的表達(dá)變化
　　 為了研究多疣壁虎脊髓橫斷損傷后GFAP的表達(dá)變化，探討壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓再生能力的關(guān)系。本實驗設(shè)計并實施壁虎脊髓橫斷損傷模型，采用實時定量PCR和Western Blot 方法檢測GFAP mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化；采用免疫熒光組織化學(xué)法觀察增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞其形態(tài)及數(shù)量的變化。結(jié)果顯示

9、，在壁虎脊髓橫斷損傷后GFAP 在基因和蛋白的水平上反應(yīng)類似，即損傷后1天表達(dá)即有微量上調(diào),3天到達(dá)小高峰，隨后開始下降，在2周時接近正常水平；免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示：在脊髓損傷后GFAP 在灰質(zhì)區(qū)無明顯增殖，在脊髓白質(zhì)區(qū)的腹側(cè)和兩側(cè)，顯示為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、突起增多，但通過對脊髓損傷截面L10以下2 mm 脊髓段連續(xù)切片的細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目無顯著性增加。結(jié)果提示，多疣壁虎脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)在時間和空

10、間上具有局限性，與哺乳類和人類脊髓損傷后強烈的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)截然不同，這種獨特的局限性可能有利于壁虎脊髓損傷后的再生。
　　 小結(jié)：本實驗首次成功克隆了壁虎GFAP mRNA 全長基因，獲知其生物學(xué)性狀，應(yīng)用GST 融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了壁虎GFAP 原核表達(dá)載體并進行體外表達(dá)。通過壁虎原核表達(dá)的GFAP 免疫兔，制備了GFAP多克隆抗血清。為后續(xù)研究壁虎星形膠質(zhì)細(xì)胞與脊髓損傷再生的關(guān)系提供了研究工具。本研究還表明，壁虎G