Dynamin-1與內側顳葉癲癇發(fā)生的關系及機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　癲癇(epilepsy)是一種常見的神經系統(tǒng)疾病，在兒童期發(fā)病率明顯高于其他年齡階段，發(fā)病率約為3.5‰～6.6‰，其發(fā)病形式多樣，病因復雜，對病人的危害巨大。其中難治性癲癇以內側顳葉癲癇(mesialtemporal lobe epilepsy，MTLE)較為常見，海馬硬化為其突出的臨床病理特征。迄今為止，MTLE的治療一直是癲癇治療的難點，MTLE的發(fā)病機制仍是近幾十年來癲癇研究的熱點與難點。
　　

2、近幾年來，關于突觸囊泡循環(huán)相關調控蛋白的研究已成為一個新的熱點。突觸囊泡循環(huán)是維持神經遞質傳遞的基礎，突觸囊泡通過胞吐和胞吞作用完成一次突觸囊泡循環(huán)。大量研究證實，癲癇患者神經元突觸有明顯的功能異常，這種病態(tài)突觸通過突觸囊泡的快速循環(huán)再生使正常情況下每秒僅能傳播數次或數十次神經沖動的突觸傳遞功能增加到每秒數十次到數百次，使癇性放電得以迅速擴布。深入研究囊泡的再循環(huán)細節(jié)以及生理調控的方式和位點，為臨床尋找有效治療靶點，具有重要的理論和實際

3、意義。
　　Dynamin-1，又稱發(fā)動蛋白-1，是一個96 kD的大分子量三磷酸鳥苷酶(GTPase)，為GTPase家族成員，近20年的研究從基因、細胞信號調控、蛋白功能等多方面已證實，dynamin-1在網格蛋白介導的突觸囊泡胞吞及囊泡循環(huán)利用中發(fā)揮至關重要的作用。非dynamin-1依賴的其他調控機制能夠維持生理狀態(tài)下基本正常的突觸囊泡胞吞功能，而dynamin-1在維持神經元高頻、長時程放電過程中發(fā)揮了關鍵作用。因此，以

4、dynamin-1作為靶點進行干預，可以阻斷囊泡在高頻、長時程電興奮事件中的快速循環(huán)而發(fā)揮作用，而對生理狀態(tài)下的突觸傳遞活動影響甚少。由此可見，dynamin-1有希望成為一個非常有前景、完全不同于傳統(tǒng)抗癲癇藥物作用機制的抗癲癇新藥研發(fā)靶點。
　　本實驗通過建立幼年大鼠MTLE模型，從一個整體、連續(xù)發(fā)展的角度探討dynamin-1在MTLE發(fā)生發(fā)展過程中的表達變化，同時在人MTLE患兒海馬組織中進行驗證。并進一步建立離體原代海馬神

5、經元癲癇細胞模型，探討dynamin-1在癲癇發(fā)生過程中的機制。從而為難治性MTLE尋找新的藥物靶點提供了一個全新的視角。
　　隨后，本實驗通過構建dynamin-14個結構域的融合蛋白，在大鼠腦神經突觸小體中篩選出63個可能與dynamin-1存在相互作用的蛋白，并選取了3個以前從未報道過與dynamin-1有相互作用的蛋白:Rab GDI、C1C-3以TUC-4b，利用免疫共沉淀對其進行自然條件下與dynamin-1相互作用的

6、研究。
　　本研究分為三部分:
　　研究方法:
　　1.利用本實驗室已建立的方法，用氯化鋰-匹羅卡品誘導3周齡Sprague-Dawley(SD)幼鼠出現癲癇發(fā)作，根據MTLE發(fā)生發(fā)展過程取三個時間點（急性期、潛伏期、慢性期）一共分為6個組:急性期對照組、急性期模型組、潛伏期對照組、潛伏期模型組、慢性期自發(fā)發(fā)作組、慢性期對照組。運用western blot及免疫組化技術動態(tài)觀察MTLE大鼠海馬組織中dynamin-1及

7、磷酸化dynamin-1蛋白的表達變化。并收集人難治性MTLE術后海馬標本，western blot及免疫組化方法檢測其表達變化。
　　2.利用新生SD大鼠培養(yǎng)海馬神經元，應用無鎂細胞外液灌流方法誘導癇性放電，建立癲癇細胞模型。應用dynamin-1抑制劑dynasore抑制dynamin-1的活性，western blot及免疫熒光技術觀察癲癇細胞模型中dynamin-1及磷酸化dynamin-1蛋白的表達變化，并利用轉鐵蛋白進

8、一步研究抑制dynamin-1蛋白活性后癲癇細胞模型胞吞量的改變。
　　3.構建dynamin-14個功能結構域的融合蛋白，與大鼠腦突觸小體相互作用，利用GST-pull down聯合質譜技術篩選出dynamin-1在大鼠腦神經突觸小體中的相互作用蛋白。驗證2個已有報道中確切與dynamin-1存在相互作用的蛋白，endophilins以及amphiphysins。并選取3個以前從未報道過的dynamin-1相互作用的蛋白，Rab

9、 GDI、C1C-3以及TUC-4b，應用免疫共沉淀對其進行自然條件下與dynamin-1相互作用的研究。
　　研究結果:
　　1.Western blot及免疫組化結果顯示磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期及慢性期以及MTLE患兒海馬組織中表達較同時期對照組顯著降低(P＜0.05)，在MTLE大鼠潛伏期的表達與同時期對照組相比無差異。而dynamin-1總蛋白在MTLE大鼠各期、MTLE患兒及對照組海馬之間表

10、達無明顯差異。
　　2.Western blot及免疫組化結果顯示磷酸化dynamin-1蛋白在癲癇細胞模型組中表達較對照組顯著降低(P＜0.05)，經dynamin-1抑制劑dynasore預處理的癲癇細胞模型組中磷酸化dynamin-1蛋白表達則與正常對照組基本一致，同時，dynasore對正常對照組磷酸化dynamin-1蛋白表達無明顯影響。Dynamin-1總蛋白在海馬神經元癇性放電模型及對照組中表達無明顯差異。激光顯微共

11、聚焦顯示癲癇細胞模型組海馬神經元胞吞量較正常對照組明顯增多(P＜0.05)。應用dynasore抑制dynamin-1蛋白活性表達后，癇性放電組海馬神經元胞吞量顯著減少。同時，dynasore對正常對照組海馬神經元胞吞量無明顯影響。
　　3.本實驗共篩選出63個可能與dynamin-1存在相互作用的蛋白，其中PRD域鑒定出36個蛋白，PH域14個蛋白，GED域7個蛋白，GTPase域6個蛋白。已知的dynamin-1相互作用蛋白e

12、ndophilins和amphiphysins被證實與dynamin-1存在相互作用關系。未報道蛋白RabGDI以及C1C-3與dynamin-1存在相互作用關系，然而，TUC-4b與dynamin-1之間未檢測出相互作用。
　　研究結論:
　　1.磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期、慢性期以及MTLE患兒海馬組織中表達較同時期對照組顯著降低，提示dynamin-1可能通過磷酸化/去磷酸化過程在癲癇發(fā)生發(fā)展過程

13、中發(fā)揮重要作用。
　　2.癲癇細胞模型組磷酸化dynamin-1蛋白表達下降，轉鐵蛋白胞吞量增多，但抑制dynamin-1活性后，其表達與正常對照組無明顯變化，同時正常對照組dynamin-1活性抑制前后磷酸化dynamin-1蛋白表達無明顯差異。提示dynamin-1可能通過影響其磷酸化/去磷酸化及調節(jié)突觸囊泡胞吞在癲癇發(fā)病機制中起重要作用，但對生理狀態(tài)下正常細胞表達無影響。
　　3.篩選了63個可能與dynamin-1存