幼鼠內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制及丙戊酸早期干預(yù)的療效和機(jī)理研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 癲癇(epilepsy)是小兒神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，發(fā)病率為3.5‰～6.6‰。內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是最常見的難治性癲癇之一，以海馬硬化為其突出的臨床病理特征。迄今為止，MTLE的治療一直是癲癇治療的難點，藥物治療及手術(shù)治療都未能取得令人滿意的療效。因此，有關(guān)海馬硬化的MTLE綜合征的發(fā)病機(jī)制、對抗癲癇藥物治療的反應(yīng)以及耐藥機(jī)制等仍是近幾十年

2、來癲癇研究的熱點與難點。
　　 兒童時期的癲癇以及癲癇綜合征與成年期有很大不同。發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于其結(jié)構(gòu)與功能以及與癲癇有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)、受體尚未完全成熟，癇性發(fā)作對未成熟大腦發(fā)生發(fā)展的影響以及未成熟大腦對抗癲癇藥物治療反應(yīng)都隨著大腦發(fā)育各階段的不同而有很大的差異。大量研究表明，在伴有海馬硬化性顳葉癲癇的成人患者中有相當(dāng)高比例可追問到兒童早期有長時間癇性發(fā)作史，尤其是熱性驚厥史。幼年早期長時間癇性發(fā)作后大腦可塑性發(fā)生的改變對

3、個體能產(chǎn)生長遠(yuǎn)的影響，與MTLE的形成密切相關(guān)。因此，研究發(fā)育階段幼鼠癇性發(fā)作后大腦各階段的結(jié)構(gòu)和功能與癲癇發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及對抗癲癇藥物治療的反應(yīng)對于MTLE病理生理研究有著重要的意義。
　　 近年來有關(guān)MTLE的研究多集中在神經(jīng)再生和突觸可塑性、神經(jīng)細(xì)胞損傷、細(xì)胞代謝和蛋白合成、神經(jīng)傳遞和信號傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架的改變、離子通道等各個方面，但絕大多數(shù)研究均局限于某一個時間點的某一個方面，缺乏系統(tǒng)、連續(xù)的觀察。而癲癇的發(fā)生是不斷發(fā)展

4、和變化的，因此，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分離鑒定幼鼠MTLE模型發(fā)生發(fā)展的各個時間段差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，將各個階段的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行全景式比較分析，功能歸類，從一個整體、連續(xù)發(fā)展的角度探討MTLE發(fā)病機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用廣譜抗癲癇藥物丙戊酸(valproate，VPA)在早期對幼鼠模型進(jìn)行干預(yù)，探討VPA早期干預(yù)對幼鼠MTLE模型的療效以及相關(guān)治療機(jī)制，并收集人難治性MTLE術(shù)后海馬標(biāo)本進(jìn)行臨床驗證，從多個角度

5、探討難治性MTLE的發(fā)病機(jī)制以及VPA早期干預(yù)的治療機(jī)制，為今后通過藥物治療難治性MTLE提供一個新的視角。
　　 研究方法：
　　 本研究分為三部分：
　　 1.分別用10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、100mg/kg四種劑量的匹羅卡品對3周齡Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)出癲癇發(fā)作，尋求匹羅卡品的最佳致癇劑量；致癇后連續(xù)觀察8周，比較MTLE模型鼠的行為學(xué)、腦電圖的改變，尼氏染色

6、以及Timm染色觀察海馬的形態(tài)學(xué)改變，對慢性MTLE模型進(jìn)行鑒定。
　　 2.根據(jù)MTLE發(fā)生發(fā)展過程取三個時間點(急性期、潛伏期、慢性期)一共分為6個組：急性對照組、急性模型組、潛伏對照組、潛伏模型組、慢性自發(fā)發(fā)作組、慢性無發(fā)作組。采用二維凝膠電泳技術(shù)分離各組大鼠海馬總蛋白，PDQuest軟件識別各組間差異表達(dá)蛋白質(zhì)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，生物信息學(xué)軟件對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析、功能歸類，構(gòu)建與幼鼠MT

7、LE發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。Western blot技術(shù)對部分差異蛋白的表達(dá)進(jìn)行印證。
　　 3.在自發(fā)發(fā)作開始出現(xiàn)的潛伏期末用VPA對MTLE模型持續(xù)干預(yù)2周，觀察其對治療的反應(yīng)，尼氏染色和Timm染色觀察治療后的海馬形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行療效評估；同時，對治療與未治療兩組的大鼠海馬蛋白表達(dá)譜進(jìn)行分析比較，結(jié)合MTLE模型各階段之間的差異表達(dá)蛋白譜，尋找與VPA早期干預(yù)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)并運(yùn)用westernblot技術(shù)印證

8、其表達(dá)情況。進(jìn)一步地，收集人難治性MTLE術(shù)后海馬標(biāo)本，western blot檢測其表達(dá)情況進(jìn)行臨床驗證。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.匹羅卡品10 mg/kg組的誘導(dǎo)成功率為0％，30mg組誘導(dǎo)成功率為30％，50 mg/kg組的誘導(dǎo)成功率為60％，100 mg/kg組的誘導(dǎo)成功率為10％，其最佳致癇劑量為50 mg/kg；慢性MTLE模型成功率為63.3％。慢性MTLE模型鼠出現(xiàn)自發(fā)部分運(yùn)動性發(fā)作，腦電圖呈現(xiàn)典型癲

9、癇樣放電，尼氏染色顯示有神經(jīng)元脫失以及變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生；Timm染色可見到異常苔蘚纖維出芽，異常興奮環(huán)路形成。
　　 2.建立了幼鼠慢性MTLE模型發(fā)生發(fā)展各個階段的海馬二維凝膠電泳圖譜。共鑒定了各個階段差異表達(dá)的蛋白質(zhì)共110個，這些蛋白主要參與的功能有：細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞連接、能量代謝、突觸形成和神經(jīng)遞質(zhì)釋放、熱休克蛋白、信號通路調(diào)節(jié)分子等；通過比較分析發(fā)現(xiàn)部分蛋白在癲癇發(fā)生發(fā)展的各個階段有不同表達(dá)。并用Western b

10、lot技術(shù)對部分差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了驗證，其結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果基本一致。
　　 3.發(fā)現(xiàn)VPA早期干預(yù)可完全控制幼鼠MTLE模型的癲癇發(fā)作。尼氏染色和Timm染色的結(jié)果表明VPA具有神經(jīng)保護(hù)作用，能阻止神經(jīng)元脫失和異常苔蘚纖維出芽，并發(fā)現(xiàn)突觸相關(guān)蛋白synapsin-1、dynamin-1和neurogranin在VPA治療組與未治療組中有差異表達(dá)。Western blot技術(shù)檢測synapsin-1、dynamin-

11、1和neurogranin在大鼠模型和臨床樣本中的表達(dá)水平與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果一致。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.本研究成功誘導(dǎo)出具有自發(fā)發(fā)作的幼鼠慢性MTLE模型，在發(fā)作形式、腦電圖以及海馬形態(tài)學(xué)改變等均符合人類MTLE的特征。為今后研究幼年期癇性發(fā)作對成年慢性MTLE的影響以及藥物干預(yù)等提供了一個比較理想的實驗性動物模型。
　　 2.首次建立了幼鼠慢性MTLE模型海馬的連續(xù)、動態(tài)的凝膠電泳圖譜；共鑒定了

12、各階段差異表達(dá)的蛋白質(zhì)110個，這些蛋白可能與MTLE發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，為全面探討慢性顳葉癲癇的病理生理機(jī)制及尋求最佳的藥物作用靶點提供新的思路。
　　 3.丙戊酸早期干預(yù)幼鼠MTLE模型可完全控制癲癇發(fā)作，為今后臨床上藥物控制難治性MTLE提供了可能的最佳干預(yù)時間點；突觸相關(guān)蛋白synapsin-1、dynamin-1、neurogranin與慢性MTLE模型發(fā)病機(jī)制、丙戊酸早期干預(yù)的治療機(jī)理相關(guān)，可能是今后關(guān)于難治性MTLE