雙黃連注射液類過敏反應(yīng)及其炎癥機制研究.pdf

1、雙黃連注射液(SHLI)在臨床上用于治療上呼吸道感染尤其是病毒性感染療效很好，然而由于時有過敏樣反應(yīng)發(fā)生，使其臨床應(yīng)用受限。本研究的目的是對SHLI的急性過敏樣反應(yīng)進行深入研究，明確其主要特點，找出致敏物質(zhì)，探討其致敏機制，從而為SHLI工藝優(yōu)化、質(zhì)量控制和臨床安全用藥提供基礎(chǔ)。
　　本論文主要由兩部分構(gòu)成:文獻綜述和實驗研究，實驗研究包括SHLI過敏樣反應(yīng)特點、SHLI類過敏物質(zhì)研究和SHLI類過敏反應(yīng)炎性機制研究。
　　

2、1.文獻綜述:包括①雙黃連注射液不良反應(yīng)研究進展;②CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細胞功能研究進展。本部分主要從這兩個方面對相關(guān)文獻進行了歸納整理和總結(jié)提煉，從而為本研究的開展提供了思路和相關(guān)指導。
　　2.實驗研究
　　2.1 SHLI過敏樣反應(yīng)特點研究本研究采用豚鼠主動過敏試驗(ASA試驗)和大鼠被動皮膚過敏試驗(PCA試驗)對SHLI進行致敏性評價研究，并以本實驗室前期建立的小鼠類過敏試驗和大鼠被動皮膚過敏試驗對

3、SHLI進行致類過敏作用研究。ASA試驗中，用不同劑量SHLI（加佐劑和不加佐劑）對豚鼠進行腹腔致敏，隔日一次，共致敏三次，末次致敏后14天，靜脈注射致敏劑量兩倍的SHLI進行激發(fā)，結(jié)果致敏豚鼠出現(xiàn)明顯的過敏癥狀。為了區(qū)分類過敏反應(yīng)，直接給未致敏豚鼠靜脈注射與激發(fā)劑量相同的SHLI，豚鼠出現(xiàn)與致敏反應(yīng)中相似的過敏癥狀。豚鼠耳和肺組織病理結(jié)構(gòu)都顯示以炎癥改變?yōu)橹鳌CA試驗中，采用與ASA試驗相同的致敏方式對BN大鼠進行致敏，分別于末次致

4、敏后10天、14天、17天和21天取致敏大鼠血清，稀釋不同滴度后皮內(nèi)注射到正常Wistar大鼠背部皮膚，24h后給Wistar大鼠靜脈注射與致敏劑量相同的SHLI和伊文思藍(EB)混合溶液進行激發(fā)，結(jié)果注射SHLI致敏血清局部未出現(xiàn)明顯藍斑。小鼠類過敏反應(yīng)中，在SHLI受試物中加入EB生理鹽水溶液給ICR小鼠靜脈注射，然后通過耳廓藍染發(fā)生率和藍染面積評分及耳廓中EB含量判斷血管通透性增高的程度從而了解其誘發(fā)類過敏反應(yīng)程度。由結(jié)果可知，小

5、鼠耳廓發(fā)生明顯藍染，并具有劑量相關(guān)性。另外小鼠耳和肺組織病理改變與豚鼠相似，以炎癥改變?yōu)橹?，耳組織超微結(jié)構(gòu)顯示類過敏反應(yīng)的病理基礎(chǔ)是血管通透性增高。大鼠皮膚類過敏試驗:本研究采用改良的Miles分析方法，即采用靜脈注射0.6％伊文思藍作為血管滲出的指示劑，觀察了皮內(nèi)注射不同濃度SHLI后局部血管滲出表現(xiàn)。結(jié)果顯示，隨著SHLI濃度增大，注射SHLI局部皮膚的藍斑也逐漸增大。Beagle犬類過敏試驗中，分別一次性靜脈注射臨床2倍和4倍濃度

6、的SHLI后，Beagle犬出現(xiàn)了明顯的過敏樣反應(yīng)癥狀，且隨著濃度的升高，癥狀明顯加重，而且4倍濃度時，血壓出現(xiàn)了即刻下降，在給藥后2小時才緩慢恢復到正常。綜合以上試驗結(jié)果分析，SHLI主要誘發(fā)類過敏反應(yīng)，其組織病理變化以炎癥反應(yīng)為主，血管通透性增高是其發(fā)生的病理基礎(chǔ)，類過敏反應(yīng)的發(fā)生及程度與濃度和劑量過高具有明顯正相關(guān)。由于ASA和PCA試驗的敏感性和局限性，所以SHLI的過敏試驗結(jié)果僅供參考。
　　2.2 SHLI類過敏反應(yīng)物

7、質(zhì)研究本研究借助小鼠類過敏評價模型對SHLI致類過敏物質(zhì)進行篩選。首先將與SHLI中含量相同的SHLI三種主要藥效成分黃芩苷、綠原酸和連翹苷的EB混合溶液分別靜脈注射入小鼠體內(nèi)，結(jié)果各組小鼠耳廓均未見明顯藍染。下一步又對黃芩提取物、金銀花提取物和連翹提取物三種中間體進行了致類過敏反應(yīng)研究，方法與前相似，結(jié)果顯示連翹提取物可使小鼠發(fā)生明顯類過敏反應(yīng)，所以連翹提取物中可能存在致類過敏物質(zhì)。接下來用化學萃取手段對連翹提取物的不同極性部位進行了

8、萃取，將四個部分的萃取物包括氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取提取物分別注射入小鼠體內(nèi)，按照類過敏評價方法對其致類過敏作用進行評價，結(jié)果顯示類過敏反應(yīng)最強部位為正丁醇部分。然后采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對正丁醇部位的活性成分進一步分離和鑒定，共分離出11個酚類化合物，最后選擇了連翹苷、連翹酯苷A、連翹酯苷E、牛蒡苷進行致小鼠類過敏反應(yīng)研究，結(jié)果顯示，連翹酯苷A可導致小鼠發(fā)生明顯的類過敏反應(yīng)，并且進一步研究表明，連翹酯菅A的致致類過敏作用具有明顯劑量效

9、應(yīng)關(guān)系。
　　2.3 SHLI類過敏反應(yīng)炎性機制研究將致敏劑量的SHLI給予ICR小鼠靜脈注射，5min后取小鼠血漿和肺組織，通過ELISA方法檢測血漿和肺勻漿液中的組胺含量，30min后再取類過敏小鼠血清和肺，ELISA方法檢測其中的VEGF、TNF-α和IL-10等細胞因子含量，結(jié)果顯示，血漿和肺組織組胺含量都明顯升高。運用抗組胺藥氯雷他定對小鼠進行預防給藥，再靜脈注射SHLI，小鼠類過敏反應(yīng)明顯減輕。另外檢測了SHLI對肥大

10、細胞系RBL-2H3細胞的脫顆粒刺激作用，顯示SHLI可刺激RBL-2H3細胞脫顆粒釋放組胺等活性物質(zhì)。血清內(nèi)的VEGF含量也有升高趨勢，其它細胞因子未見明顯改變。另外將致敏劑量的SHLI作用于白細胞減少模型（注射環(huán)磷酰胺）、T淋巴細胞缺失小鼠（Balb/c和SCID小鼠）及不同T細胞亞群移植（免疫磁珠細胞分選）免疫重建SCID小鼠模型，結(jié)果顯示白細胞減少的ICR小鼠比未減少小鼠類過敏反應(yīng)輕，T淋巴細胞缺失小鼠則不發(fā)生類過敏反應(yīng)，不同亞

11、群T細胞移植SCID小鼠對SHLI的類過敏反應(yīng)不一樣，CD4+CD25-T細胞和CD4-T細胞移植小鼠發(fā)生明顯的類過敏反應(yīng)，并且小鼠體內(nèi)炎性細胞因子也明顯升高。CD4+CD25+Treg細胞移植小鼠則沒有發(fā)生明顯類過敏反應(yīng)。以上試驗結(jié)果證實SHLI可通過直接刺激肥大細胞釋放組胺導致類過敏反應(yīng)，組胺受體拮抗劑可以緩解這種反應(yīng)。SHLI還能激活T細胞從而釋放一系列炎性因子（包括IL-5、IL-6等）發(fā)揮致類過敏作用，CD4+CD25+Tre

12、g能抑制CD4和CD8細胞功能從而抑制SHLI的類過敏反應(yīng)。以上均說明炎性機制在SHLI的類過敏反應(yīng)中起著重要作用。
　　3.結(jié)論：
　　(1)初步證明SHLI的過敏樣反應(yīng)特點主要為類過敏反應(yīng)，炎性改變和血管通透性升高是其主要組織病理學機制。
　　(2)連翹酯苷A可能是SHLI主要致敏物質(zhì)，其致敏特點具有劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　(3)直接刺激肥大細胞釋放組胺可能是SHLI類過敏反應(yīng)的主要原因，另外，白細胞尤其是淋巴細