適合評價中藥注射液過敏反應的動物模型研究.pdf

1、中藥注射劑是中藥的創(chuàng)新劑型,與傳統(tǒng)中藥比較具有生物利用度較高,起效迅速等特點,能較好的發(fā)揮中藥治療急危重癥的特點,尤其在心血管系統(tǒng)疾病、病毒性疾病和腫瘤的治療中具有不可替代的作用。但是隨著中藥注射液研發(fā)和生產(chǎn)的規(guī)模不斷擴大以及在臨床的廣泛應用,其安全性問題逐漸暴露出來。目前我國的43個中成藥劑型中,注射劑這一種劑型引起的不良反應就占了75％,這種情況已經(jīng)引起了國內外的廣泛關注。但是長期以來,由于對中藥注射液的不良反應重視不夠,造成該方面

2、的研究基礎極為薄弱。中藥注射液嚴重不良反應中尤以過敏反應的比例為最高,且反應類型多為速發(fā)型變態(tài)反應,但目前國內外均未建立針對中藥致敏原的敏感動物模型和標準評價方法,嚴重影響了中藥注射液的臨床前安全性評價,使其在臨床上的應用受到了很大的限制。
　　 本研究以清開靈注射液、雙黃連注射液及其中的疑似致敏成分黃芩苷、綠原酸作為致敏原,以天花粉蛋白為陽性對照,通過觀察過敏反應發(fā)生率、過敏反應程度、組胺增長率、靶器官病變率和病變程度,對BN

3、大鼠和豚鼠在評價中藥注射液過敏反應中的適用性進行比較,篩選出適合評價中藥注射液過敏反應的動物模型；并通過全身主動過敏試驗(ASA)和被動皮膚過敏試驗(PCA)對該模型的特異性進行研究；在此基礎上,通過對致敏參數(shù)(致敏劑量、致敏次數(shù)、致敏途徑、致敏時間間隔)和激發(fā)參數(shù)(攻擊劑量、攻擊途徑、攻擊間隔、攻擊體積)的明確,建立一套適合評價中藥注射液過敏反應的規(guī)范化研究方法；在建立的動物模型上,以清開靈注射液、雙黃連注射液、魚腥草注射液、穿琥寧注

4、射液、燈盞花素注射液為受試樣本,以青霉素為陽性對照,通過對肥大細胞脫顆粒、IgE抗體含量、血清中過敏介質和Th1／Th2型細胞因子含量的研究,對中藥注射液過敏反應的機制進行探討。本研究獲得國家自然科學基金重大研究計劃的資助。
　　 1.BN大鼠和豚鼠對評價中藥注射液過敏反應的適用性研究
　　 本研究以清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為致敏原,直接對BN大鼠和豚鼠進行致敏,致敏途徑為腹腔注射、致敏劑量為人臨床的等

5、倍劑量,致敏次數(shù)為3次,隔日1次,在末次致敏后的第14天進行攻擊,攻擊途徑為一次性靜脈推注,攻擊體積為致敏體積的2倍。攻擊后觀察過敏反應癥狀,根據(jù)SFDA的全身致敏性評價標準來計算過敏反應率、過敏反應程度；采用ELISA法檢測血清、肺組織和氣管中組胺含量并計算組胺增長率；HE染色法光鏡下觀察肺組織和氣管病理改變并計算靶器官病變率和病變程度,以此為依據(jù)對BN大鼠和豚鼠在評價中藥注射液過敏反應中的適用性進行比較。
　　 結果顯示:以

6、清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為受試樣本,①BN大鼠各組的過敏反應發(fā)生率分別為55.56％、61.11％、75.00％和83.33％,而豚鼠各組的過敏反應發(fā)生率分別為22.22％、27.77％、16.67％和41.67％,BN大鼠對四種受試的中藥注射液及藥物成分的過敏率均明顯高于豚鼠,兩種動物比較均具有顯著性差異。②四種受試樣本致BN大鼠的過敏程度均比豚鼠嚴重,其中雙黃連注射液組和黃芩苷組的BN大鼠過敏反應程度與豚鼠比較具有

7、顯著性差異。③BN大鼠血清、肺組織和氣管中的組胺增長率均明顯高于豚鼠,其中清開靈注射液的血清、肺組織、氣管,雙黃連注射液的血清和肺組織,黃芩苷的血清,綠原酸的肺組織中的組胺增長率與豚鼠比較均具有顯著性差異。④四種受試樣本BN大鼠各組的肺組織病變率分別為66.67％、72.22％、66.67％和41.67％,而豚鼠各組的肺部病變率分別為44.44％、44.44％、25.00％和8.33％,BN大鼠對四種受試樣本的肺組織病變率均明顯高于豚鼠

8、,其中黃芩苷組的BN大鼠肺組織病變率與豚鼠比較具有顯著性差異。BN大鼠各組的氣管病變率與豚鼠各組比較沒有顯著性差異。⑤四種受試樣本致BN大鼠肺組織的病理改變程度均比豚鼠嚴重,其中雙黃連注射液組和黃芩苷組的BN大鼠肺組織病變程度與豚鼠比較具有顯著性差異；四種受試樣本致BN大鼠氣管的病理改變程度與豚鼠比較均沒有顯著性差異。
　　 試驗結果證明:在評價中藥注射液過敏反應中,BN大鼠的敏感性明顯高于豚鼠,說明BN大鼠可能為評價中藥注射液

9、過敏反應的適宜動物模型。
　　 2.中藥注射液致BN大鼠過敏反應的特異性研究
　　 2.1中藥注射液致BN大鼠的全身主動過敏試驗(ASA)
　　 本實驗以清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為受試樣本,以天花粉蛋白為陽性對照,通過觀察BN大鼠的過敏反應癥狀,Elisa法檢測血清、肺組織和氣管中組胺含量的變化,HE染色法光鏡下觀察心臟、肝臟、脾臟、肺、氣管、胃和小腸的病理改變,并從中篩選出特異性的靶器官,來明

10、確中藥注射液致BN大鼠過敏反應的特異性。
　　 結果顯示:①BN大鼠對清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸均產(chǎn)生了特異性的過敏反應的癥狀和表現(xiàn)。BN大鼠產(chǎn)生的過敏反應癥狀主要包括躁動、顫抖、搔鼻、噴嚏、呼吸急促等,多在攻擊后10-20min內出現(xiàn),15min以內緩解,嚴重時出現(xiàn)靜臥、肌張力下降、體表溫度下降、抽搐、暈厥等過敏性休克的癥狀,甚至出現(xiàn)死亡。②BN大鼠過敏反應模型的血清、肺組織和氣管中的組胺含量均明顯升高,與正常

11、對照組比較均具有顯著性差異,說明BN大鼠的過敏反應均引起明顯的組胺釋放,組胺釋放到靶器官并釋放入血。③在過敏反應的靶器官篩選中發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、胃、小腸均沒有出現(xiàn)明顯的病理改變,而各組BN大鼠的肺組織和氣管均出現(xiàn)了明顯的炎癥性病理改變,說明肺和氣管為中藥注射液過敏反應的主要靶器官。④陽性藥對照組BN大鼠也出現(xiàn)了特異性的過敏反應的癥狀,主要包括靜臥、排糞(大便稀溏)、呼吸困難、呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)、肌張力下降、反應敏感度下降、喘息等癥狀,多在

12、攻擊后10min內出現(xiàn),30min-1h后緩解；血清、肺組織和氣管中均可見明顯的組胺釋放；在過敏反應的靶器官篩選中發(fā)現(xiàn),BN大鼠肺組織和氣管中出現(xiàn)了明顯的炎癥性病理改變,據(jù)綜合判斷,肺和氣管為陽性對照(天花粉蛋白)致BN大鼠過敏反應的主要靶器官。
　　 試驗結果證明:BN大鼠對以清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為代表的中藥注射液和藥物成分能產(chǎn)生特異性的全身速發(fā)型過敏反應。
　　 2.2中藥注射液致BN大鼠的被動

13、皮膚過敏試驗(PCA)
　　 本實驗以清開靈注射液、雙黃連注射液、魚腥草注射液、穿琥寧注射液和燈盞花素注射液為受試樣本,以青霉素鈉為陽性對照,對BN大鼠致敏后制備抗血清,以1:25和1:50兩個稀釋度的抗血清對Balb／c小鼠進行致敏和激發(fā),通過觀察伊文思藍滲出和藍斑反應來評價BN大鼠在中藥注射液致皮膚被動過敏反應中的特異性。
　　 結果顯示,1:25和1:50稀釋度的抗血清各組均出現(xiàn)了明顯的伊文思藍滲出,對于多數(shù)中藥注

14、射液,1:25稀釋度組的伊文思藍吸光度高于1:50稀釋度組,說明1:25稀釋度抗血清中IgE抗體的含量較高。1:25稀釋度的抗血清攻擊后,各藥物組均有動物出現(xiàn)了藍斑反應,藍斑直徑大于5mm,其中雙黃連注射液小劑量組、魚腥草注射液小劑量組和陽性藥對照組均有3只動物出現(xiàn)了藍斑,反應陽性率為75％,與陰性對照組比較具有顯著性差異；而1:50稀釋度的抗血清攻擊后,只有雙黃連注射液小劑量組和陽性藥對照組出現(xiàn)了藍斑反應,反應陽性率分別為25％和50

15、％。
　　 試驗結果證明:清開靈注射液、雙黃連注射液、魚腥草注射液、穿琥寧注射液、燈盞花素注射液均能通過BN大鼠制備的抗血清,使Balb／c小鼠產(chǎn)生明顯的皮膚被動過敏反應,證明BN大鼠為研究中藥注射液皮膚被動過敏反應的適宜動物模型。
　　 3.中藥注射液致BN大鼠過敏反應動物模型的規(guī)范化研究
　　 本研究以清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸作為受試樣本,以豚鼠作為對照,采用不同的致敏參數(shù)和激發(fā)參數(shù):致敏劑

16、量(人臨床等倍劑量、人臨床2倍劑量)、致敏途徑(ip、iv),攻擊次數(shù)(1次、2次)、攻擊時間間隔(末次致敏后的第14天和第21天)來進行全身主動過敏試驗,通過不同參數(shù)下對過敏反應發(fā)生率,組胺含量,肺組織、氣管的病變率和病變程度的比較,來明確適用于BN大鼠過敏反應動物模型的規(guī)范化條件。
　　 結果顯示:①第1次攻擊BN大鼠各組均出現(xiàn)了過敏反應,其過敏反應率基本上都高于第2次攻擊,因而確定攻擊的次數(shù)為1次,攻擊的時間間隔應為末次致

17、敏后的第14d。②iv小劑量組(致敏途徑為靜脈注射、致敏劑量為人臨床等倍劑量)對各受試樣本均產(chǎn)生了過敏反應,對清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸的過敏反應發(fā)生率分別為50％、66.67％、75％和75％；iv小劑量組血清和組織中的組胺含量均明顯升高；iv小劑量組BN大鼠對清開靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸的肺組織病變率分別為50％、50％、75％和25％,與同組的過敏反應發(fā)生率具有較好的對應關系,因此確定致敏途徑為靜脈注

18、射、致敏劑量為臨床人的等倍劑量,而相應的攻擊劑量為臨床人的2倍劑量。③在相同的致敏和攻擊條件下,BN大鼠組的過敏反應發(fā)生率、組胺釋放、肺組織、氣管的病變率和病變程度基本上都高于豚鼠組,說明在同等條件下,BN大鼠對中藥注射液過敏反應的敏感性優(yōu)于豚鼠,重復性驗證了前面的試驗結果。
　　 試驗結果證明:以BN大鼠為動物模型評價中藥注射液的過敏反應,其致敏和攻擊條件應規(guī)范化為:致敏劑量為人臨床等倍劑量、致敏間隔為1日、致敏途徑為靜脈注射

19、,攻擊劑量為致敏劑量的2倍、攻擊途徑為靜脈一次性注射、攻擊次數(shù)為1次、攻擊時間間隔為末次致敏后的第14天,這種方法在動物數(shù)量較少的情況下也較為適用。
　　 4.中藥注射液對BN大鼠過敏反應機制的研究
　　 本研究以清開靈注射液、雙黃連注射液、魚腥草注射液、穿琥寧注射液和燈盞花素注射液為受試樣本,以青霉素為陽性對照,對BN大鼠進行致敏和激發(fā),通過觀察BN大鼠的過敏反應率、肺和氣管的病變率來評價中藥注射液致BN大鼠的過敏反應

20、情況,通過觀察腹腔肥大細胞脫顆粒,血清中IgE抗體、過敏介質和細胞因子含量的變化,來揭示中藥注射液的致敏反應機制。
　　 結果顯示:①各注射液組的BN大鼠均出現(xiàn)了明顯的過敏反應癥狀,小劑量組過敏反應發(fā)生率均高于大劑量組,與對照組比較具有顯著性差異:各注射液組的肺組織和氣管均出現(xiàn)了明顯的炎癥性病理改變。②各注射液組肥大細胞陽性率均明顯升高,其中清開靈注射液組、魚腥草注射液組、穿琥寧注射液組與對照組比較具有顯著性差異；陽性對照藥青霉

21、素組的肥大細胞陽性率明顯升高,與對照組比較具有顯著性差異,且其陽性率高于中藥注射液各組。③中藥注射液誘導過敏反應后,BN大鼠血清中IgE抗體含量明顯升高,與對照組比較具有顯著性差異。④中藥注射液誘導過敏反應后,BN大鼠血清中組胺、5.羥色胺、前列腺素D2和白三烯B4的含量均明顯升高,細胞因子IFN-γ和IL-4的含量均明顯升高,大部分組的IFN-γ／IL-4比值出現(xiàn)了降低的趨勢。
　　 試驗結果證明:在BN大鼠動物模型上,中藥注

22、射液可引起IgE抗體介導的速發(fā)型過敏反應,其過敏反應機制可能與以下環(huán)節(jié)相關:①促進肥大細胞脫顆粒后,釋放組胺、5-羥色胺、前列腺素D2和白三烯B4等過敏介質；②誘導Th1／Th2細胞分泌的細胞因子向Th2偏移,從而促進IgE抗體合成。
　　 綜上所述,我們得出以下研究結論:
　　 ●與豚鼠比較,BN大鼠可能為評價中藥注射液過敏反應的適宜動物模型；
　　 ●在BN大鼠動物模型上,能產(chǎn)生特異性的全身主動過敏反應和皮膚

23、被動過敏反應；
　　 ●采用BN大鼠模型對中藥致敏原進行評價時,其規(guī)范化參數(shù)為:致敏劑量為人臨床等倍劑量、致敏次數(shù)為3次、致敏間隔為1日、致敏途徑為靜脈注射,攻擊劑量為致敏劑量的2倍、攻擊途徑為靜脈注射、攻擊次數(shù)為1次、攻擊時間間隔為末次致敏后的第14天；
　　 ●在BN大鼠動物模型上,中藥注射液可引起IgE抗體介導的速發(fā)型過敏反應,其過敏反應機制可能與以下環(huán)節(jié)相關:①促進肥大細胞脫顆粒后,釋放組胺、5-羥色胺、前列腺素