大鼠腦創(chuàng)傷后氯喹及頭孢曲松對(duì)海馬神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和死亡率的特點(diǎn)。TBI后的繼發(fā)性腦損害可以導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失、智力障礙，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的痛苦和損失，已成為全球性的社會(huì)問(wèn)題。早年關(guān)于顱腦損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的探索主要集中在細(xì)胞凋亡方面，經(jīng)過(guò)多年研究其發(fā)生過(guò)程及通路已經(jīng)較為清楚。近年來(lái)真核生物中細(xì)胞自噬發(fā)揮的作用越來(lái)越多的被人們所重視，成為了科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。

2、>　　最近的研究證實(shí)自噬存在于TBI損傷后的病理過(guò)程中，對(duì)自噬調(diào)控的深入研究或許是會(huì)為治療TBI后神經(jīng)元繼發(fā)性損傷和修復(fù)提供新的藥物作用靶點(diǎn)。因此，搞清神經(jīng)細(xì)胞自噬的發(fā)生過(guò)程及調(diào)控靶點(diǎn)，闡明TBI后神經(jīng)細(xì)胞的最終死亡通路，對(duì)于探討和避免TBI后神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡，同時(shí)給予針對(duì)性的治療具有重要意義。
　　以往本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)TBI后自噬主要發(fā)生在神經(jīng)元而非膠質(zhì)細(xì)胞中，并對(duì)神經(jīng)元中ERK1/2及JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)其自噬的機(jī)制進(jìn)行了

3、系列研究，但將神經(jīng)元自噬作為藥物的作用靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步的探討。另一方面，膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織中含量最多的細(xì)胞，其中的重要因子谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLT-1)能否對(duì)TBI后的神經(jīng)元自噬發(fā)揮調(diào)節(jié)作用呢？這也需要我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和探索。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和GLT-1激活劑頭孢曲松進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)藥物對(duì)創(chuàng)傷大腦海馬區(qū)GLT-1、炎性因子IL-1及自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)的影響，為以神經(jīng)元自噬作為治療靶點(diǎn)的研究開(kāi)辟新的思路，也為臨

4、床腦損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將160只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組:①Sham組(n=40)，②TBI組(n=40)③氯喹組（n=40）④頭孢曲松組(n=40)。每組分為創(chuàng)傷后12h、24h、48h及72h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。使用Marmarou法建立中度彌漫性TBI模型。對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè):①HE染色觀察海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化;②干濕比重稱量法檢測(cè)腦組織含水量;③免疫組化共聚焦法檢測(cè)LC3的表達(dá)定位情況;④Western-blot法檢

5、測(cè)GLT-1、IL-1和LC3的蛋白表達(dá)。⑤另取40只大鼠在創(chuàng)傷后7-11天行Morris水迷宮測(cè)試，對(duì)其空間學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量采用Gel-Doc軟件分析系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS18.0。兩兩比較使用q檢驗(yàn)，組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 HE染色結(jié)果:Sham組海馬區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、數(shù)目較多、排列規(guī)則，無(wú)明顯的病理學(xué)改變

6、。TBI組創(chuàng)傷后組織疏松，明顯水腫，微血管周?chē)g隙和細(xì)胞周?chē)g隙的增寬顯著;海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂、數(shù)量顯著減少，胞漿的嗜色性明顯減弱，核固縮，核仁部分消失。氯喹組組織水腫較輕，微血管周?chē)g隙和細(xì)胞周?chē)g隙只可見(jiàn)輕度增寬;海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，數(shù)目與TBI組比較略有增多，胞核固縮較TBI組明顯恢復(fù)。頭孢曲松組組織水腫不明顯，微血管周?chē)g隙和細(xì)胞周?chē)g隙略有增寬;海馬區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整，數(shù)目與TBI組比較有所增多，胞核固縮較

7、TBI組明顯恢復(fù)。
　　2大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)結(jié)果:TBI組的平均逃避潛伏期與Sham組比較顯著增加(P＜0.05)。氯喹組在9、10天與TBI組相比平均逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.05)。頭孢曲松組在傷后7-10天與TBI組比較平均逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.05)。在創(chuàng)傷后11天的空間搜索實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，與Sham組相比，TBI組穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)所在象限路程比及時(shí)間比均顯著減少(P＜0.05);與TBI組相比，氯喹組以及頭

8、孢曲松組穿越平臺(tái)次數(shù)和2個(gè)比值均顯著增加（P＜0.05）。
　　3腦組織水含量測(cè)定:Sham組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織水含量未見(jiàn)差異。TBI組的腦組織水含量隨時(shí)間升高，在12-72h均顯著高于Sham組。氯喹組24-72h的含水量顯著低于TBI組(P＜0.05)。頭孢曲松組12-72h的含水量均顯著低于TBI組(P＜0.05)。
　　4 GLT-1的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組GLT-1有較強(qiáng)的表達(dá)，表達(dá)量在各時(shí)

9、間點(diǎn)無(wú)差異。與Sham組比較，TBI組GLT-1的蛋白表達(dá)量傷后12h出現(xiàn)明顯降低(P＜0.05)，24h最低，雖然之后有所上調(diào)，但在創(chuàng)傷后72h的表達(dá)依然低于Sham組(P＜0.05)。頭孢曲松組GLT-1表達(dá)量顯著高于TBI組，在傷后12-72h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5 IL-1的Western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組僅有少量IL-1表達(dá)，其表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)差異。TBI組與Sham組比較，傷后12

10、h增高(P＜0.05)，24h達(dá)到高峰(P＜0.05)，持續(xù)高表達(dá)至創(chuàng)傷后48h(P＜0.05)，創(chuàng)傷72h后IL-1蛋白表達(dá)有所下降，但仍顯著高于Sham組(P＜0.05)。氯喹組IL-1蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)與TBI組類(lèi)似，其表達(dá)量略低于TBI組，在傷后24h和48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。頭孢曲松組表達(dá)量顯著低于TBI組，其在傷后12-72h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6 LC3與NeuN的共

11、聚焦檢測(cè)結(jié)果:FITC標(biāo)記的綠色熒光顯示自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的表達(dá)，TRITC標(biāo)記的紅色熒光顯示神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的表達(dá)。在TBI后24h，NeuN（紅色）與LC3（綠色）在海馬區(qū)存在共定位。
　　7 LC3 western blot檢測(cè)結(jié)果:Sham組LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量的比值在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化。TBI組與Sham組比，在傷后12h開(kāi)始LC3Ⅱ/LC3Ⅰ有所升高(P＜0.05)，在24h達(dá)到高峰(P＜0.05)，創(chuàng)傷后48-

12、72hLC3Ⅱ/LC3Ⅰ有所下降，但仍高于Sham組(P＜0.05)。氯喹組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ顯著低于TBI組，在傷后12-48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。頭孢曲松組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ略低于TBI組，在傷后24-48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:在大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中，自噬抑制劑氯喹和GLT-1激活劑頭孢曲松均能影響自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)，達(dá)到調(diào)控神經(jīng)元自噬的目的，同時(shí)具有一定的抗炎及抗興奮毒作用