Calpastatin在大鼠離體心臟缺血-再灌注損傷時(shí)表達(dá)的改變.pdf

1、Calpastatin（鈣蛋白酶抑素）是鈣激活蛋白水解酶calpain（鈣蛋白酶）的內(nèi)源性特異性阻滯劑，由N末端的非同源序列L區(qū)和120-140個(gè)氨基酸殘基的4個(gè)重復(fù)序列1、2、3、4區(qū)（domain 1、2、3、4）構(gòu)成的蛋白質(zhì)。Domain1-4承擔(dān)calpain阻滯作用，然而，結(jié)構(gòu)域L（domain L）卻沒(méi)有任何calpain阻滯作用，長(zhǎng)期以來(lái)被稱為是功能不明的結(jié)構(gòu)域。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)calpastatin還有鈣通道活化作用，

2、而且domain L單獨(dú)也具有鈣通道活化作用，說(shuō)明calpastatin的鈣通道活化作用可能是由domain L來(lái)承擔(dān)的，并提出了calpastatin的雙重作用假說(shuō)：一方面活化鈣離子通道使鈣內(nèi)流增加（domain L承擔(dān)），另一方面又抑制鈣激活的蛋白水解酶calpain（domain 1-4承擔(dān)）。然而，關(guān)于domain L的病理生理學(xué)作用及意義目前尚無(wú)任何研究報(bào)道。
　　 缺血/再灌注（isehemia reperfusio

3、n，I/R）損傷是指在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，組織器官的損傷反而加重的現(xiàn)象。隨著休克治療的進(jìn)步以及溶栓療法、動(dòng)脈搭橋術(shù)、心肺腦復(fù)蘇、心臟外科體外循環(huán)等方法的建立和推廣，使許多組織器官缺血后重新得到血液再灌注，心肌等組織的缺血/再灌注損傷也成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，其發(fā)生機(jī)制可能與缺血/再灌注期自由基生成過(guò)多、鈣超載、微血管損傷和能量生成不足等有關(guān)，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。此外，有研究認(rèn)為缺血/再灌注損傷時(shí)高濃度的細(xì)胞內(nèi)Ca2

4、+很容易激活磷脂酶和鈣敏感性蛋白如calpain。Calpain普遍存在于各種細(xì)胞中，有文獻(xiàn)指出calpain的激活是心肌缺血再灌注的早期特征。研究也表明calpastatin可抑制calpain的活性，從而一定程度緩和了鈣超載，保護(hù)細(xì)胞，提示calpastatin在缺血再灌注損傷的防治中可能發(fā)揮了一定的作用。
　　 因此，本課題采用離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型，研究了calpastatin的domain L和domain1

5、-4的表達(dá)與缺血/再灌注損傷發(fā)生的相關(guān)性，旨在探討capastatin特別是其domain L的病理生理學(xué)意義，并為防治心肌損傷提供新的可能途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法：
　　 1、試劑與儀器：
　　 RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）。Trizol reagent（美國(guó)Gibco公司），calpastatin抗體（英國(guó)Saskatchewan大學(xué)惠贈(zèng)），NP-40，PMSF，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，TEM

6、ED，過(guò)硫酸銨，甘氨酸，蔗糖，溴酚藍(lán)，SDS，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（中衫金橋），脫脂奶粉，Tween-20，預(yù)染蛋白Marker（均來(lái)自Biosharp公司）。PCR儀（杭州博日公司），HoferminVE凝膠成像儀（UVP，USA），垂直電泳儀（北京六一公司）等。
　　 2、模型建立：
　　 健康SD大鼠，體重250～300g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。1％戊巴比妥鈉50mg/㎏，及肝素500U/㎏，腹腔注射。

7、麻醉后，迅速沿前正中線剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，剪開(kāi)心包膜，左手在心臟基底部和大血管連接處提起心臟，盡可能在離心端遠(yuǎn)處剪斷主動(dòng)脈，剪斷心臟與其他血管的聯(lián)系，取出心臟，放入用混合氣體飽和的K-H液中，輕輕擠壓心臟數(shù)次，排空心臟內(nèi)血液，修剪血管連接處多余組織，保留適當(dāng)主動(dòng)脈長(zhǎng)度，套入主動(dòng)脈插管后用絲線結(jié)扎，懸掛在langendorff裝置上，然后放入心臟恒溫室，打開(kāi)三通管，開(kāi)始灌流。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中溫度控制在37℃、灌注壓100㎝ H2O，并于灌注

8、過(guò)程中持續(xù)通入95％O2、5％CO2的混合氣體。
　　 模型分組（1）正常灌注組（對(duì)照組），離體大鼠心臟用K-H液灌注25min。（2）缺血組，離體大鼠心臟用K-H液灌注25min后停止灌注45min和灌注25min后停止灌注60min組（3）再灌注組，離體大鼠心臟用K-H液灌注25min后停止灌注45min復(fù)灌注15min組、30min組；離體大鼠心臟用K-H液灌注25min后停止灌注60min復(fù)灌注5min組、30min組。

9、灌流后分別取大鼠左心室，凍存?zhèn)溆谩?br>　　 3、RT-PCR
　　 Trizol法提取大鼠左心室的總RNA，按照TaKaRa RNA PCR（AMV）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，采用AMV（avian myeblastosia virus）反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA的第一鏈，每次反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。
　　 用primer premier5軟件設(shè)計(jì)引物，通過(guò)NCBI網(wǎng)站上的BLAST對(duì)引物的可靠性進(jìn)行比對(duì)

10、確認(rèn)，之后由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。
　　 表1，引物的核酸序列，退火溫度及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度
　　 4、Westem blot
　　 提取大鼠左心室中的總蛋白，加入SDS樣品緩沖液2.01μl，100℃煮沸5min，12％SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入1:400倍稀釋的calpastatin抗體，室溫30℃孵育2h。取出孵育完畢的膜，TBST洗滌3次，每次5min

11、。加入1:6000倍稀釋的二抗，同上室溫孵育2h。取出二抗孵育完畢的膜，在清洗好的膜上滴加ECL發(fā)光，成像分析。
　　 5、數(shù)據(jù)處理
　　 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行one-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)值用mean±SD表示，P<0.05被認(rèn)為差異有顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、半定量RT-PCR檢測(cè)心肌缺血/再灌時(shí)calpastatin的doma

12、in L mRNA表達(dá)情況。心肌缺血45min及60min時(shí)，calpastatin的domain L mRNA水平與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.05）。再灌注15min后domain L mRNA水平有所恢復(fù)；再灌注30min時(shí)，domain LmRNA表達(dá)再次降低。
　　 2、半定量RT-PCR檢測(cè)心肌缺血/再灌時(shí)calpastatin的domain 1-2、domain 3-4mRNA的表達(dá)情況。心肌缺血45min及60m

13、in時(shí)，calpastatin的domain 1-2、domain 3-4mRNA均與對(duì)照組比較，缺血45min組及60min組表達(dá)均明顯下調(diào)（P<0.01，45min組；P<0.05，60min組）。再灌注15min后domain 1-2、domain 3-4 mRNA水平有所恢復(fù)。
　　 3、Western-blot法檢測(cè)缺血/再灌時(shí)calpastatin蛋白表達(dá)。Calpstatin表達(dá)變化趨勢(shì)和mRNA一致。以缺血45m

14、in表達(dá)下調(diào)最明顯，再灌后有所恢復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1、心肌缺血時(shí)calpastatin的domain L mRNA表達(dá)水平下調(diào)；再灌注時(shí)表達(dá)有所恢復(fù)。
　　 2、心肌缺血時(shí)calpastatin的domain 1-2、domain 3-4 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，再灌注時(shí)表達(dá)也有所恢復(fù)。
　　 3、心肌缺血/再灌時(shí)calpastatin蛋白水平，在缺血45min明顯下調(diào)。
　　 本研究結(jié)果提