燃煤污染型氟中毒大鼠腦組織膽堿能系統(tǒng)及NOS-NO改變在腦損傷機制中的作用.pdf

1、地方性氟中毒（簡稱地氟病）是典型的地球化學性疾病，累及世界許多國家和地區(qū)，我國是受害較重的國家之一。地氟病主要分為飲水型、燃煤污染型和飲茶型三種。貴州省是燃煤污染型氟中毒最為嚴重的地區(qū)，尤其以畢節(jié)地區(qū)為重災區(qū)，造成燃煤污染型氟中毒的主要因素是當?shù)鼐用袷秤煤扛叩娜济汉婵具^的玉米、辣椒等食物所致。過量的氟可通過血腦屏障進入腦組織，在腦組織內(nèi)蓄積，對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害作用。慢性氟中毒對腦損傷的影響已成為當前國際氟研究中較為熱門的研究問題。有

2、關燃煤污染型氟中毒引起腦損傷的實驗研究報道較少。
　　慢性氟中毒腦損傷的機制仍不十分清楚，目前認為與過量氟引起的氧化應激水平升高和膽堿能系統(tǒng)改變等有關。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能系統(tǒng)與認知、學習記憶功能、對大腦其它神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)等有關。氟中毒對腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的影響已引起學者們的關注。最近幾年，一氧化氮(nitric oxide，NO)作為自由基在氟中毒引起的氧化應激研究方面開始引起人們的重視。
　　為了深入研究氟的神經(jīng)損傷機制

3、，特別是探討燃煤污染型氟中毒腦損傷的分子發(fā)生機制，我們復制了燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代模型來觀察氟中毒大鼠腦組織的病理學變化和對仔鼠腦發(fā)育的影響;研究燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代空間學習記憶能力改變;研究燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代腦組織膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的改變，包括尼古丁受體(Nicotinic acetylcholine receptors， nAChRs)α3、α4、α7亞單位在蛋白和mRNA表達水平改變，膽堿酯酶(Cholines

4、terase，ChE)活性改變;研究燃煤污染型氟中毒大鼠及其子代腦組織NOS在蛋白和mRNA表達水平改變和NO含量改變，并分析nAChRs、NOS蛋白表達水平、NO含量與大鼠認知能力的相關關系，探討腦組織膽堿能系統(tǒng)和NOS/NO改變在燃煤污染型氟中毒腦損傷機制中的作用。
　　方法:燃煤污染型氟中毒大鼠模型復制:SD大鼠48只，按染氟劑量分為對照組(Control)、低氟組(Lower Fluoride，LF)、高氟組(Hight

5、Fluoride，HF)三組，每組各8只大鼠，雌雄各半。對照組喂飼常規(guī)飼料，低氟組、高氟組大鼠以燃煤污染型地方病氟中毒重病區(qū)燃煤烘烤的當?shù)赜衩诪橹饕暳希渲撇煌匡暳衔桂B(yǎng)大鼠，復制燃煤污染型氟中毒動物模型，實驗期分別為3個月和6個月。燃煤污染型氟中毒子代模型復制:SD大鼠32只，隨機分為2組（每組16只，雌性12只，雄性4只），即高氟組和對照組，飼養(yǎng)6個月后雌雄合籠，取其所生一月齡仔鼠作為研究對象，各10只仔鼠。動物在交配前、交配

6、、懷孕和哺乳期間喂飼方法與相同組別的成年大鼠一致。
　　實驗結束時，用Morris水迷宮檢測成年大鼠及子代大鼠空間學習記憶能力的變化;用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)、尼氏染色(Nissl)及電子顯微鏡顯示神經(jīng)細胞的病理變化;用硝酸還原酶法測定腦組織NO含量，比色法測定腦組織ChE活性;用蛋白印跡方法測定腦組織nAChRα3、α4、α7及nNOS蛋白表達水平，用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(Real-

7、time quantitativereverse transcription-polymerase chain reaction)測定腦組織nAChRα3、α4、α7及nNOS的mRNA水平。
　　成年大鼠研究結果:與對照組比較，氟負荷指標:染氟3、6個月之低氟組、高氟組大鼠尿氟、骨氟、腦組織氟含量均顯著性增加，并隨染氟時間延長和染氟劑量增加氟含量增加更明顯。生長發(fā)育:染氟3個月及染氟6個月大鼠體質(zhì)量有降低趨勢。形態(tài)學改變:染氟3

8、、6個月之低氟組、高氟組大鼠神經(jīng)細胞平均灰度值均顯著性增加，尼氏小體顯著性下降。超微結構:染氟6個月低氟組與高氟組大鼠神經(jīng)細胞核膜局部缺如、線粒體部分嵴和膜融合、消失;突觸前膜內(nèi)線粒體部分嵴和膜融合、模糊不清、突觸間隙局部融合，以高氟組大鼠神經(jīng)細胞超微結構病變更嚴重。行為學改變:染氟3個月高氟組大鼠學習能力顯著性下降，記憶能力無顯著性改變;染氟6個月，低氟組與高氟組大鼠學習能力與空間記憶能力均顯著性下降，過量氟對大鼠學習記憶的影響，早期

9、主要以高濃度氟影響學習能力，隨染氟時間延長，低濃度氟亦可學習能力，而且高濃度氟不僅影響大鼠學習能力，空間記憶能力亦受影響。膽堿能系統(tǒng)改變:染氟3、6個月之低氟組和高氟組大鼠nAChRα3、α4、α7蛋白表達水平、mRNA水平、ChE活性均顯著性下降（P＜0.05或＜0.01），提示氟可在早期、低劑量時使大鼠nAChRs在蛋白與mRAN水平發(fā)生改變。nNOS改變:染氟3、6個月之低氟組和高氟組大鼠腦組織nNOS蛋白表達均顯著性增加（P＜0

10、.05或＜0.01），mRNA水平均顯著性下降（P＜0.05），過量氟對nNOS蛋白與mRNA水平的影響在染氟早期及低濃度氟時即已發(fā)生。NO含量改變:染氟3個月高氟組大鼠腦組織NO含量顯著性下降（P＜0.05），染氟6個之低氟組和高氟組大鼠腦組織NO含量顯著性升高（P＜0.05或＜0.01），過量氟可引起大鼠腦組織NO含量改變。相關性分析顯示過量氟引起大鼠學習記憶能力降低與腦組織nAChRs蛋白表達下降及nNOS蛋白表達增加、NO含量增

11、加有關，其間有量效關系。
　　高氟組子代大鼠研究結果:與對照組仔鼠比較，尿氟、骨氟、腦組織氟含量均顯著性增加;體質(zhì)量、腦組織重量及腦器官系數(shù)均顯著性降低;神經(jīng)細胞細胞核核膜局部有缺如，染色質(zhì)邊集;突觸間隙融合;突觸前膜內(nèi)線粒體模糊不清，突觸結構模糊不清;學習與記憶能力均顯著性降低;nAChRα3、α4其蛋白和mRNA基因水平均顯著性降低，nAChRα7亞單位蛋白水平顯著性下降，mRNA基因水平顯著性升高;ChE活性均顯著性下降;n

12、NOS蛋白表達水平和mRNA基因表達水平均顯著性增高;NO含量顯著性增加。相關性分析顯示過量氟引起子代學習記憶能力降低與腦組織nAChRs蛋白表達下降及nNOS蛋白表達增加、NO含量增加有關，其間有量效關系。
　　綜上所述，燃煤污染型氟中毒在早期及低濃度時即可引起大鼠腦組織nAChRα3、α4和α7蛋白水平降低，mMRA基因水平變化;以及與神經(jīng)遞質(zhì)相關的ChE活性下降;引起腦組織nNOS蛋白水平增加，mMRA基因水平改變，NO含量

13、改變;早期低濃度燃煤氟主要影響大鼠學習能力，晚期高濃度燃煤氟不僅影響大鼠學習能力亦可影響空間記憶能力?？赡苁沁^量氟刺激nNOS表達持續(xù)性增加，NO含量改變，導致自由基含量增加或清除不足，損傷神經(jīng)細胞結構，影響nAChRs蛋白及mRNA表達水平，從而降低大鼠空間學習記憶能力。燃煤污染型氟中毒仔鼠神經(jīng)發(fā)育改變、學習記憶能力降低，亦可能是由于過量氟引起nNOS表達增加，導致NO含量增加，從而造成神經(jīng)細胞受損和nAChRs功能降低所致。相關性分