燃煤型氟中毒大鼠骺板軟骨組織損傷與TGF-β-Smad傳導通路關系研究.pdf

1、目的：模擬病區(qū)人群生活情況，復制燃煤型氟中毒、燃煤型氟中毒伴低蛋白低鈣及燃煤型氟中毒伴高鋁的大鼠模型，動態(tài)觀察燃煤型氟中毒大鼠不同時期骺板軟骨形態(tài)結構改變情況，以及氟對大鼠軟骨生長過程中轉化生長因子β1（TGF-β1）、大鼠骨成型蛋白2（BMP-2）、大鼠母親DPP同源物4（Smad-4）表達的影響，探討燃煤型氟中毒大鼠軟骨損傷發(fā)生的可能發(fā)病機制及伴有低蛋白低鈣、高鋁時對軟骨組織損傷的影響。
　　方法：
　　1.將150只斷

2、乳兩周的SD大鼠按體重隨機分入對照組、中氟組、高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組。每組30只（組內雌雄各半），分籠喂養(yǎng)，自由飲食，飼料配方如下：
　?。?）對照組：食用自然曬干玉米加麥麩、大豆粉等制成的飼料（其中玉米所占比例68％，飼料含氟5.2mg/kg，含蛋白質0.18Kg/Kg，含鈣8g/Kg），
　?。?）中氟組：食用自然曬干玉米與病區(qū)含氟煤烘干玉米混合后加麥麩、大豆粉等制成飼料（其中病區(qū)含氟煤烘干玉米所占比例

3、30%，自然曬干玉米所占比例38%，飼料含氟47.8mg/kg，含蛋白質0.18Kg/Kg，含鈣8g/Kg）。
　?。?）高氟組及高氟伴高鋁組：食用病區(qū)含氟煤烘干玉米加麥麩、大豆粉等制成的飼料（其中病區(qū)含氟煤烘干玉米所占比例68%，飼料含氟96mg/kg，含蛋白質0.18Kg/Kg，含鈣8g/Kg）。
　?。?）高氟伴低鈣低蛋白組：食用病區(qū)含氟煤烘干玉米加麥麩、自然曬干玉米等制成的飼料（其中病區(qū)含氟煤烘干玉米占比例68%，自

4、然曬干玉米12%，飼料含氟96mg/kg，含蛋白質0.09Kg/Kg，含鈣4g/Kg）。
　　飲水配方如下：
　?。?）對照組、中氟組、高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組飲用自來水（含氟0.699mg/L,含鋁0.2mg/L）。（貴陽市供水總公司）。
　?。?）高氟伴高鋁組飲用自來水（貴陽市供水總公司）加AlCl3（含氟0.699mg/L,含鋁90mg/L）。
　　2．動態(tài)觀察各組大鼠染氟期間牙齒的變化情況：每周定時檢查

5、大鼠氟斑牙情況，根據對大鼠氟斑牙分度方法，判定大鼠氟斑牙的嚴重情況。
　　3．每組30只大鼠均隨機分成三批，每批10只（雌雄各半），分別于第60天、第120天、第180天處死。處死之前收集24小時尿液，用于尿氟測定。取左側膝關節(jié)，利用HE染色觀察大鼠的骺板軟骨組織形態(tài)結構，測骺板軟骨厚度、骺板軟骨增值層細胞數和肥大層細胞數。取右側膝關節(jié)，利用酶聯免疫吸附劑法（ELISA）測定大鼠軟骨組織SMAD-4、TGF-β1、BMP2的表達。

6、
　　4．大鼠骨氟、尿氟測：采用離子選擇電極法、高溫灰化-氟離子選擇電極法測定大鼠尿氟、骨氟含量
　　結果：
　　1.大鼠的一般情況
　　實驗期間，對照組精神較好，毛色有光澤，各實驗組大鼠較之對照組精神較為萎靡，毛色光澤度下降。各個實驗組體重增長較對照組較為緩慢，在染毒第60天、120天、180天時高氟伴低蛋白低鈣組體重較對照組、中氟組、高氟組、高氟伴高鋁組差別均有統計學差異（p＜0.05）。
　　2.大鼠

7、氟斑牙檢查及氟斑牙分度方法
　　在染氟第四周，觀察到高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組開始出現輕度氟斑牙。在染氟第60d、第120d、第180d，中氟組、高氟組、高氟組伴高氟營養(yǎng)不良、高氟伴高鋁組較對照組氟斑牙發(fā)生率更高（p＜0.05）；在染氟第120d、180d高氟組、高氟組伴高氟營養(yǎng)不良、高氟伴高鋁組較中氟組差別有統計學意義（p＜0.05）。
　　3．大鼠尿氟、骨氟含量
　　在染氟各個時期各染氟組大鼠尿氟、骨氟含量均高于對

8、照組，且高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組和高氟伴高鋁組與對照組差別有統計學意義（p＜0.05）；高氟伴低蛋白低鈣組大鼠尿氟、骨氟高于高氟組，差別有統計學意義（p＜0.05）；在染毒第120d、180d高氟組尿氟、骨氟濃度高于高氟伴高鋁組，差別有統計學意義（p＜0.05）。
　　對與同一個實驗組，隨著染毒時間增長，大鼠尿氟、骨氟濃度逐漸增高。
　　4.觀察實驗大鼠軟骨組織病理學改變
　?。?）大鼠骺板軟骨的組織形態(tài)學觀察

9、>　　實驗各個時期，對照組大鼠的骺板軟骨邊緣整齊，增值層細胞縱向堆積成柱，肥大層軟骨細胞體積較增值層細胞大，程空泡狀，細胞核固縮；染氟組與對照組相比，骺板邊緣不齊，骺板厚度普遍增厚，軟骨細胞鈣化延遲，增值層和肥大層細胞層數增多，高氟伴低蛋白低鈣組骺板增厚，細胞柱排列紊亂。高氟伴高鋁組增值層軟骨偶爾可見結節(jié)樣增生；隨染氟時間延長，大鼠骺板組織病變加重，高氟伴低蛋白低鈣組出現大量壞死區(qū)。
　?。?）各組大鼠骺板厚度測量
　　對于

10、同一實驗組不同時期比較，隨著大鼠飼養(yǎng)時間延長，所有組別大鼠骺板厚度均呈現下降趨勢。不同時期三批大鼠各染氟組骺板厚度與對照組比較均明顯增厚，差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著染氟劑量越高，骺板厚度逐漸增厚，三批大鼠高氟組骺板厚度均高于中氟組（P＜0.05）；高氟伴高鋁組大鼠骺板厚度較高氟組低，且在染氟第60d、120d差異有統計學意義；高氟伴低蛋白低鈣組骺板厚度與高氟組比較無明顯差別。
　?。?）各組大鼠骺板增值層、肥大層細

11、胞層數測量
　　對于同一組大鼠不同時期的比較，隨著染氟時間的延長，各組大鼠骺板軟骨組織的增值層細胞層數均逐漸降低（p＜0.05）。
　　不同時期三批大鼠各染氟組骺板增值層、肥大層的細胞層數均多于對照組，且隨著染氟劑量增高細胞層數逐漸增加，差別有統計學意義（p＜0.05）；高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組骺板增值層、肥大層細胞層數較高氟組均降低。5.各組大鼠骺板組織TGF-β1、BMP-2、Smad-4的表達
　　對于同

12、一個實驗組大鼠不同時期，隨著染氟時間延長，各組大鼠骺板組織中TGF-β1、BMP-2、Smad-4含量逐漸降低（p＜0.05）。
　　在各個染氟同一時期，各個染氟組骺板組織中TGF-β1、Smad-4含量均高于對照組（p＜0.05），且隨染氟劑量增高，大鼠骺板組織中TGF-β1、Smad-4含量逐漸增高；高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組骺板軟骨TGF-β1、Smad-4含量均較高氟組低，在染氟60d、180d差別有統計學意義（P＜

13、0.05）。各個染氟組骺板組織BMP-2含量隨染氟劑量增高有上升趨勢，但差別無統計學意義（P＞0.05）。高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組骺板軟骨BMP-2含量較對照組差別無統計學意義（P＞0.05）。
　　結論：
　　1.本次試驗成功復制了燃煤型氟中毒動物模型。
　　2.燃煤型氟中毒大鼠出現了骺板軟骨組織的損傷，主要表現在氟中毒大鼠骺板組織增厚；肥大層、增值層細胞層數增多。
　　3.高氟伴低蛋白低鈣組大鼠骺板組