H1N1亞型SIV河南株的分離鑒定、HA基因的克隆和序列分析及熒光定量PCR診斷方法的建立.pdf

1、豬流感是世界范圍內(nèi)常見的呼吸系統(tǒng)傳染病之一，早在上世紀(jì)二十年代就開始在美洲流行。常與其它病原共同感染而加重了對世界各國的養(yǎng)殖業(yè)的危害。此外，由于豬被稱為是流感病毒的組合器，豬流感病毒因而在公共衛(wèi)生方面也有著十分重要的意義。流感病毒亞型眾多和容易變異的特點給該病的診斷和防治帶來了諸多挑戰(zhàn)。H1N1是豬流感最常見的亞型之一，在我國多個省份都有過報道。為了研究豬流感病毒的分子流行病學(xué)變化規(guī)律，找到準(zhǔn)確、敏感的診斷方法，為豬流感的防治奠定分子生

2、物學(xué)角度的基礎(chǔ)和依據(jù)，本試驗從河南本地豬場分離了H1N1亞型豬流感病毒，并建立了能夠?qū)Σ×线M(jìn)行定量檢測的實時熒光定量PCR診斷方法。 病毒被命名為A/Swine/Henan/407/2005(H1N1)(簡稱為SHN407)，為熱不穩(wěn)定型，對酸敏感，能導(dǎo)致小白鼠發(fā)病、死亡。從存活的小白鼠血清中可以檢測到特異性抗體，EID50，ELD50分別為10-6.5和10-1.75。從GenBank上下載了世界各地多個典型H1N1亞型毒株H

3、A基因，在編碼區(qū)以外相對保守區(qū)設(shè)計了一對特異性引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增出SHN407株的HA基因，然后將其克隆到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后將陽性菌株的重組質(zhì)粒測序。序列分析發(fā)現(xiàn)該毒株的HA基因全長1701bp。HA全基因共編碼566個氨基酸，其中HA1包含330個、HA2包含221個。共有7個糖基化位點，其中HA1上有5個、HA2上有2個。裂解位點附近沒有堿性氨基酸存在，不具有高致病性毒株的特征

4、。HA基因的同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該毒株與香港、中國內(nèi)地、北美的古典H1N1亞型分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與歐洲各國流行株的親緣關(guān)系較近，為典型的類禽H1N1亞型豬流感病毒。 從GenBank上下載了來自世界各地多個典型毒株的NP基因，利用DNAstar軟件進(jìn)行分析比較，在大約1300-1500bp之間發(fā)現(xiàn)了一個相對保守區(qū)。利用Premierexpress引物設(shè)計軟件找到了一對引物和相應(yīng)的探針序列。在探針的5'端以FAM標(biāo)記；3

5、'TAMRA標(biāo)記。利用上述引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增出SHN407株的部分NP基因，然后將其克隆到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后將陽性菌株測序，測序結(jié)果證實擴(kuò)增的序列完全正確。將從細(xì)菌中提取的重組陽性質(zhì)粒10倍梯度稀釋，作為陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和樣品的檢測。本試驗經(jīng)過對探針濃度、引物濃度、鎂離子濃度和退火溫度的一系列優(yōu)化比較，建立了最佳的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點均勻一致。該方