H1N1亞型豬流感抗體ELISA檢測技術的建立.pdf

1、豬流感病毒是豬流感的病原體，該病流行至今已有90年多的歷史。對于豬流感的檢測試劑盒，市場上的H1N1亞型豬流感檢測試劑盒價格昂貴。本研究的目的是借助Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)表達H1N1豬流感病毒血凝素(HA)蛋白作為檢測抗原建立HA蛋白抗體間接ELISA檢測方法。
　　 將H1N1豬流感病毒（A/swine/zhej iang/02/H1N1）株的HA全長去信號肽基因（fHA）和HA1去信號基因(sHAl)及EGFP-H

2、A(eHA)基因分別插入到pFastBacHTA轉(zhuǎn)移載體中，在細菌Tn7轉(zhuǎn)座子的作用下與DH10Bac感受態(tài)細胞中的桿狀病毒基因組發(fā)生轉(zhuǎn)座，從而形成重組桿狀病毒載體rBacmid/AcNPV/fHA、rBacmid/AcNPV/eHA、rBacmid/AcNPV/sHA1，分別轉(zhuǎn)染Sf9細胞，rBacmid/AcNPV/eHA轉(zhuǎn)染后可以看見明顯的綠色熒光蛋白的表達。rBacmid/AcNPV/fHA和rBacmid/AcNPV/sHA1

3、分別轉(zhuǎn)染Sf9細胞后，間接免疫熒光試驗(IFA)和Western-blot證實，rBacmid/AcNPV/fHA表達的fHA蛋白能與His單抗和H1N1亞型全病毒免疫的豬血清發(fā)生特異性的反應，其大小約為65kD的目的蛋白。rBacmid/AcNPV/sHA1表達的sHA1蛋白只能與His單抗發(fā)生特異性的反應，其大小約為40kD的sHA1目的蛋白。
　　 用β-丙內(nèi)酯滅活的A/swine/zhejiang/02(H1N1)株感染

4、的SPF胚尿囊液經(jīng)超速離心和蔗糖密度梯度離心純化后的病毒作為檢測抗原，探索建立全病毒的ELISA檢測方法。通過系列的條件篩選，確立了0.24ug/ml抗原包被濃度、pH8.5的Tris-HCl緩沖液為包被液、1∶400稀釋的待檢血清、酶標二抗稀釋倍數(shù)為1∶2000、1％BSA/PBST為封閉液、0.1％BSA/PBS緩沖液為樣品稀釋液、待檢血清和酶標二抗的最適反應時間均為45min;最佳顯色時間為10min的ELISA反應體系。建立的方