豬流感(H1N1亞型)神經(jīng)氨酸酶點突變拯救毒株的研究.pdf

1、豬流感(Swine Influenza，SI)是豬流感病毒感染侵入豬群中，可引起傳播流行的一種急性、熱性及高度接觸性呼吸道傳染疾病。全球范圍內(nèi)都有發(fā)生此疾病，已遍布于北美洲、亞洲、歐洲與非洲等。其危害嚴(yán)重，造成了巨大的經(jīng)濟損失，并且對人類的身體健康構(gòu)成了很嚴(yán)重的威脅。2009年發(fā)生在墨西哥和美國的豬流感風(fēng)暴(Munster et al.，2009)，引起了全球?qū)I的高度重視，再次敲響了公共衛(wèi)生的警鐘。
　　 豬流感本身所具有的

2、種間傳播特異性和豬體本身作為“孵化器”“重配器”“混合器”的特異性決定了豬流感病毒的重要性和可研究性。
　　 位于流感病毒囊膜上的重要的表面糖蛋白之一神經(jīng)氨酸酶，在流感病毒出芽，子代病毒釋放與擴散方面發(fā)揮了重要作用。在HA(血凝素)介導(dǎo)的病毒膜融合和病毒粒子感染過程中，NA(神經(jīng)氨酸酶)發(fā)揮了重要功能。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶發(fā)生突變會影響到其酶活性，進而影響病毒粒子的毒力。基于以上幾點開展一系列的研究，主要研究內(nèi)容如下：

3、　　 1.實驗研究毒株的確立和細胞適應(yīng)株的建立
　　 本研究選用的毒株是H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Tianjin/01/2004(H1N1)(以下簡稱TJ)，本毒株是2004年由實驗室人員分離得到。通過對它的一些基本研究發(fā)現(xiàn)，TJ毒株在細胞上的適應(yīng)能力很差?；诖?，通過對其在細胞上連續(xù)傳代增殖，發(fā)現(xiàn)在傳代3次后能夠達到一個很穩(wěn)定的血凝價水平，達到29。比原毒株相比，血凝價略微升高。將TJ毒株在細胞上適應(yīng)后建立的適應(yīng)

4、株稱為TJ細胞適應(yīng)株。
　　 2.點突變感染性克隆的構(gòu)建
　　 將TJ原毒株和細胞適應(yīng)株八個基因通過測序發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)氨酸酶片段中有兩個位點發(fā)生的突變(658和1254)，基于此構(gòu)建了點突變的神經(jīng)氨酸酶雙向表達載體質(zhì)粒。通過利用成熟的反向遺傳操作技術(shù)平臺，拯救出點突變病毒毒株，分別命名為TJNA658和TJNA1254。
　　 3.拯救毒株的毒力相關(guān)性研究
　　 首先，對拯救毒株做基本測定，發(fā)現(xiàn)TJNA125

5、4拯救毒株比原毒株相比，表現(xiàn)出血凝價升高4倍，EID50增強，本研究還對拯救毒株進行雞胚和BALB/c小鼠動物模型試驗。結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：與原毒株相比，TJNA1254和TJNA658毒株的毒力明顯增強，而且TJNA1254毒力增強的相對更明顯些。同時還開展了檢測攻毒小鼠肺組織中的細胞因子變化的相關(guān)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)拯救毒株刺激細胞因子表現(xiàn)出增強趨勢。最后，通過檢測神經(jīng)氨酸酶的相對活性，結(jié)果顯示：點突變的神經(jīng)氨酸酶基因蛋白的活性比原毒株的神經(jīng)氨酸