表達(dá)yenI基因的APEC重組菌的致病機理研究.pdf

1、由禽致病性大腸桿菌（Avian Pathogenic E.coli，APEC）引起的禽大腸桿菌病(AvianColibacillosis)是家禽局部或全身性感染的急性或慢性傳染性細(xì)菌疾病的總稱，造成家禽的呼吸道感染和敗血癥，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，成為最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一。隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，目前在全國大部分省市都報道過此類疾病的爆發(fā)。大腸桿菌致病機理和防控研究一直是學(xué)術(shù)界研究的重要領(lǐng)域和熱點課題;大腸桿菌致病性與其自身毒

2、力因子密切直接相關(guān)，而這些毒力因子必需共同作用于宿主機體，發(fā)揮毒力致病作用，造成機體損害。細(xì)菌毒力因子受到嚴(yán)格調(diào)控，群體感應(yīng)系統(tǒng)則參與了這一重要調(diào)控過程。本試驗研究探析了大腸桿菌群體感應(yīng)Ⅰ型系統(tǒng)的相關(guān)調(diào)控功能，為病原體和機體相互作用的深入研究和大腸桿菌感染的防控提供新穎的理論基礎(chǔ)。
　　在細(xì)菌生長過程中，能夠釋放特定信號分子;通過對這些信號分子的感知，細(xì)菌可以確定周邊環(huán)境中的同類數(shù)量，并據(jù)此調(diào)節(jié)特定信號分子相關(guān)的多種毒力基因;這種

3、現(xiàn)象被稱作群體感應(yīng)(Quorum Sensing)，而參與群體感應(yīng)系統(tǒng)的特定信號分子被稱為自體誘導(dǎo)子(Autoinducer，AⅠ)。Ⅰ型群體感應(yīng)系統(tǒng)由信號分子合成蛋白和信號分子受體構(gòu)成，即LuxⅠ和LuxR。事實上，禽源致病性大腸桿菌僅有接受信號分子的SdiA受體蛋白，缺乏LuxⅠ同源蛋白，自身不能合成AHL(N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯)信號分子，只能通過感受環(huán)境中其他菌群合成的AHL調(diào)控自身毒力。鑒于APEC毒力因子的復(fù)雜性，且APEC中

4、Ⅰ型群體感應(yīng)系統(tǒng)對細(xì)菌毒力調(diào)控機制一直未得到闡明。
　　為更好的理解Ⅰ型群體感應(yīng)系統(tǒng)功能及APEC發(fā)揮毒力作用途徑，本研究選擇禽源致病性大腸桿菌分離株CE129作為研究對象，將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌yenⅠ基因克隆入CE129中，賦予其內(nèi)源合成C6-HSL信號分子的能力，并通過生物報告菌pSB401加以確證。隨后利用λ-Red同源重組系統(tǒng)對APEC CE129菌sdiA基因進(jìn)行敲除，使其缺失感應(yīng)環(huán)境中AHL信號的能力。生長曲線實驗表明

5、野生株CE129、重組株CE129/pyenⅠ和缺失株CE129ΔsdiA與陰性對照株CE129/pBR生長無顯著差異;通過體外競爭性試驗證明Ⅰ型QS系統(tǒng)作用下重組株CE129/pyenⅠ與缺失株CE129ΔsdiA相比并未獲得生長優(yōu)勢;通過生物被膜實驗，發(fā)現(xiàn)CE129在AHL信號作用下生物被膜形成能力顯著降低，且進(jìn)一步通過外源添加梯度濃度C6-HSL信號，確定CE129受AHL信號影響的閾值濃度為84μg/mL;耐藥性試驗中，AHL影

6、響下CE129對四環(huán)素、氯霉素、氧氟沙星和諾氟沙星的抗性沒有明顯變化;雞血清殺菌實驗，AHL同樣未顯示出明顯調(diào)控功能。泳動性試驗和鞭毛fliC基因的熒光定量試驗結(jié)果顯示，鞭毛基因fliC并不受AHL信號分子影響，這一現(xiàn)象與EHEC、ETEC等其他血清型大腸桿菌迥異;重組菌CE129/pyenⅠ耐酸性基因gadA的表達(dá)比野生株下降37.1％，而耐酸性實驗并未顯示明顯差異，這一結(jié)果與豬源、人源致病性大腸桿菌有較大差異。雞巨噬細(xì)胞系HD11細(xì)

7、胞吞噬試驗和雞成纖維細(xì)胞系DF1細(xì)胞黏附試驗顯示，AHL影響下重組菌巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存能力及黏附能力顯著強于野生株，而細(xì)菌主要黏附素鞭毛表達(dá)無明顯變化，Ⅰ型菌毛表達(dá)量下降，其對HD11細(xì)胞和DF1細(xì)胞黏附增強機制尚不明晰。Ⅰ型與Ⅱ型群體感應(yīng)系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)控關(guān)系也受到進(jìn)一步探索。Ⅱ型QS系統(tǒng)重要基因中，lsrR（QS-Ⅱ受體調(diào)控基因）表達(dá)量下降46.4％。綜上所述，在Ⅰ型群體感應(yīng)系統(tǒng)影響下，禽源性大腸桿菌CE129的生物被膜形成、抗吞噬能力和