AccRoyalisin重組表達及產(chǎn)物抑菌活性研究.pdf

1、蜂王漿(royaljelly)是蜜蜂工蜂咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體(俗稱王漿腺)分泌蜂王漿的乳狀物質(zhì),是1-3齡工蜂幼蟲及蜂王的終生食料,它含有豐富的生物活性成分,多種生理活性和營養(yǎng)保健功能。中華蜜蜂(Apisceranacerana)是原產(chǎn)于我國的土著具蜂種,具有明顯優(yōu)于西方蜜蜂(Apismellifera)的抗病性。近期研究表明,中華蜜蜂抗病性優(yōu)于西方蜜蜂以及蜂王漿不易變質(zhì)的特性都與抗菌肽royalisin有關(guān)。
　　 此

2、前,本實驗室已完成了對中華蜜蜂抗菌肽Acc-Royalisin的原核表達及表達產(chǎn)物抑菌活性初步研究。本研究重點進行了原核表達放大試驗,產(chǎn)物規(guī)?；蛛x純化。在此基礎(chǔ)上,進行了原核表達產(chǎn)物抑菌譜、代表菌最低抑菌濃度、抑菌穩(wěn)定性、抑菌機理的系統(tǒng)研究。
　　 同時,進行了Acc-Royalisin基因真核表達載體構(gòu)建。首先,以含Acc-Royalisin基因的載體為模板,采用引入編碼6xHis4-EKDNA序列的5-P引物,和編碼Acc

3、-Royalisin基因的3-P引物,進行目的基因PCR擴增。然后將引入6xHis+EKDNA序列的目的基因連結(jié)到pGEX-4T-2載體的GST基因3'端。最后,以此插入GST-6xHis-EK-AccRoyalisin序列的載體pGEX-4T-2-AccRoyalisin為模板,采用根據(jù)此重組序列和酵母表達載體pPIC9K的相應(yīng)酶切位點SnabI和NotI設(shè)計的5-P和3-P引物,進行目的基因PCR擴增,得到長度約850bp的DNA片

4、段。將純化的PCR產(chǎn)物和酵母表達載體pPIC9K分別用SnabI和NotI雙酶切,酶切產(chǎn)物再分別作電泳檢測和割膠回收,連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)篩選出重組AccRoyalisin-pPIC9K陽性克隆。將AccRoyalisin-pPIC9K線性化,電擊轉(zhuǎn)化畢徹酵母GS115。抽提酵母基因組DNA,進行PCR鑒定,篩選出含目的基因的重組子。
　　 對重組酵母行誘導(dǎo)表達,表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明,表達產(chǎn)物