艱難梭菌基因重組乳鏈菌口服活菌疫苗的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的及意義： 由于乳鏈菌表達(dá)載體尚未商品化，無(wú)法通過(guò)購(gòu)買或捐贈(zèng)獲得。因而我們參照一些成熟的乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建方法及Genebank公布的序列，設(shè)計(jì)并構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)；分別用這套表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了艱難梭菌A毒素羧基末端重復(fù)序列(14CDTA)、破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)及TETC-14CDTA融合蛋白。并以表達(dá)TETC-14CDTA融合蛋白的重組乳鏈菌作為活菌疫苗，通過(guò)艱難梭菌動(dòng)物感染模型初步評(píng)價(jià)口服活菌疫苗對(duì)艱

2、難梭菌感染的預(yù)防保護(hù)作用，并探討TETC作為生物佐劑的作用。 方法： 1乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定 (1)表達(dá)系統(tǒng)的序列設(shè)計(jì) 選用適合于乳鏈菌中使用的乳酪鏈球菌的p59啟動(dòng)子作為啟動(dòng)子，選用乳鏈菌分泌型蛋白45(USP45)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和信號(hào)肽序列作為RBS和信號(hào)肽；選用Usp45基因的終止子作為終止子；在信號(hào)肽后插入多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)乳鏈菌分泌型表達(dá)載體。選用釀膿鏈球菌的emm6基因中編碼M

3、6蛋白的膜錨定序列(CWAM6)作為膜錨定蛋白的基因，T7終止子作為終止子，設(shè)計(jì)乳鏈菌膜錨定型表達(dá)載體。 (2)采用基因拼接(PCRbasedgeneassembly，PBGA)技術(shù)拼接帶有乳鏈菌的P59啟動(dòng)子、USP45的RBS、編碼USP45信號(hào)肽的基因及多克隆位點(diǎn)的基因PU，連接至克隆載體pBluescriptⅡSK(+)，構(gòu)建質(zhì)粒pBS-PU，PCR擴(kuò)增編碼USP45蛋白的基因的終止子，連接到質(zhì)粒pBS-PU，構(gòu)建成帶有

4、乳鏈菌分泌型表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒pNBC1000，測(cè)序結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)完全一致，它能將外源基因分泌表達(dá)于培養(yǎng)液上清；PCR擴(kuò)增釀膿鏈球菌的emm6基因中編碼M6蛋白的膜錨定序列(CWAM6)，連接至質(zhì)粒pET-22(+)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CWAM6基因、6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(His-tag)基因及T7終止子序列，連接至質(zhì)粒pBS-PU，構(gòu)建成帶有乳鏈菌膜錨定型表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒pNBC2000，測(cè)序結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)及Genebank公布序列完全一致，該系統(tǒng)可將

5、外源基因錨定表達(dá)于細(xì)菌的細(xì)胞壁。 2.艱難梭菌A毒素羧基末端基因克隆及其在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá) 以艱難梭菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增艱難梭菌A毒素C末端重復(fù)序列(14CDTA)，TA克隆到pGEM-Teasy載體，測(cè)序結(jié)果與Genebank公布的艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463A毒素基因同源性為100％，將測(cè)序正確的14CDTA從pGEM-Teasy載體切下，定向連接到pNBC1000和pNBC2000，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pNB

6、C1001和pNBC2001，隨后將表達(dá)14CDTA的序列(含啟動(dòng)子、信號(hào)肽及終止子)分別從pNBC1001和pNBC2001上切下，并分別連接到穿梭質(zhì)粒pTRKH2，構(gòu)建質(zhì)粒pNBCL1001和質(zhì)粒pNBCL2001，電穿孔轉(zhuǎn)化乳鏈菌，得到重組乳鏈菌LL-pNBCL1001和LL-pNBCL2001，SDS-PAGE及Western-blot驗(yàn)證14CDTA在重組乳鏈菌LL-pNBCL1001和LL-pNBCL2001內(nèi)的表達(dá)。

7、 3.破傷風(fēng)毒素C片段乳鏈菌表達(dá)載體的構(gòu)建及與14CDTA在乳鏈菌內(nèi)的融合表達(dá) 根據(jù)乳鏈菌密碼子，設(shè)計(jì)適于乳鏈菌表達(dá)的破傷風(fēng)毒素C片段(TETC)基因序列，采用二步法基因拼接TETC基因，得到1383bp大小的TETC基因，連接到質(zhì)粒pBluescriptⅡSK(+)，得到質(zhì)粒pBS-TETC，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的TETC切下定向連接到pNBC1000和pNBC2000，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pNBC1002和pNBC

8、2002，將TETC表達(dá)序列分別從質(zhì)粒pNBC1002、pNBC2002切下，分別連接到穿梭質(zhì)粒pTRKH2，構(gòu)建質(zhì)粒pNBCL1002和質(zhì)粒pNBCL2002，電穿孔轉(zhuǎn)化乳鏈菌，得到重組乳鏈菌LL-pNBCL1002和LL-pNBCL2002，SDS-PAGE及Western-blot驗(yàn)證TETC在重組乳鏈菌內(nèi)的表達(dá)。將14CDTA定向連接到質(zhì)粒pNBC1002和pNBC2002的TETC基因后構(gòu)建表達(dá)TETC-14CDTA融合蛋白的

9、表達(dá)載體pNBC1003和pNBC2003，隨后將表達(dá)融合蛋白序列從相應(yīng)的質(zhì)粒切下，連接到穿梭載體pTRKH2，得到乳鏈菌表達(dá)載體pNBCL1003和pNBCL2003，電穿孔轉(zhuǎn)化乳鏈菌，得到表達(dá)TETC-14CDTA融合蛋白的重組乳鏈菌LL-pNBCL1003和LL-pNBCL2003，SDS-PAGE及Western-blot驗(yàn)證TETC-14CDTA融合蛋白在重組乳鏈菌內(nèi)的表達(dá)。 4.重組乳鏈菌對(duì)艱難梭菌感染動(dòng)物模型的保護(hù)

10、作用 32只雄性敘利亞金黃地鼠(以下簡(jiǎn)稱金黃地鼠)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，空質(zhì)粒乳鏈菌組，分泌型乳鏈菌組，膜錨定型乳鏈菌組，每組8只，空白對(duì)照組給予生理鹽水1mL灌胃，空質(zhì)粒乳鏈菌(LL-pTRKH2)組給予帶有穿梭質(zhì)粒pTRKH2的乳鏈菌，重組分泌型乳鏈菌(LL-pNBCL1003)組給予帶有重組質(zhì)粒pNBCL1003的乳鏈菌，重組膜錨定乳鏈菌(LL-pNBCL2003)組給予帶有重組質(zhì)粒pNBCL2003的乳鏈菌，各乳鏈菌組均

11、給予1mL(5×109CFU/mL)的相應(yīng)的乳鏈菌，分別于第0、1、2、7、14、23天給不同組別的地鼠灌胃，于第7、14天灌胃前分別進(jìn)行腸道菌群分析一次，第15天各組地鼠均給予鹽酸克林霉素10mg灌胃，連續(xù)給藥1周，期間進(jìn)行腸道菌群分析及艱難梭菌分離培養(yǎng)，以確定有無(wú)菌群失調(diào)及艱難梭菌感染，最后1次給藥后4小時(shí)給予約4×105CFU的艱難梭菌進(jìn)行攻擊，攻擊后72小時(shí)內(nèi)每4小時(shí)觀察1次，此后每日觀察4次，攻擊后14天處死全部存活金黃地鼠，

12、結(jié)束實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定 采用基因拼接的方法，構(gòu)建了表達(dá)系統(tǒng)pNBC1000及pNBC2000，將EGFP基因連接到pNBC2000，得到帶有重組質(zhì)粒pNBC2000-EGFP的大腸桿菌，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌有綠色熒光，而帶有pBS-EGFP及pNBC2000質(zhì)粒的大腸桿菌未見(jiàn)熒光。表明該表達(dá)系統(tǒng)可以在大腸桿菌內(nèi)啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；將表達(dá)EGFP的表達(dá)系統(tǒng)從pNBC2000-EGF

13、P切下，連接到穿梭質(zhì)粒pTRKH2，得到重組質(zhì)粒pNBCL2000-EGFP，電穿孔轉(zhuǎn)化乳鏈菌，獲得重組乳鏈菌LLpNBCL2000-EGFP，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌帶有綠色熒光，而對(duì)照乳鏈菌未見(jiàn)熒光，表明構(gòu)建的乳鏈菌表達(dá)系統(tǒng)是可以在乳鏈菌內(nèi)表達(dá)外源蛋白的。 2.艱難梭菌A毒素羧基末端基因克隆及其在乳鏈菌內(nèi)的表達(dá) 以艱難梭菌基因DNA為模板，擴(kuò)增了14CDTA基因，并構(gòu)建了重組乳鏈菌LL-pNBCL1001和LL-

14、pNBCL2001。SDS-PAGE結(jié)果顯示LLpNBCL1001可以表達(dá)14CDTA基因，且向乳鏈菌液體培養(yǎng)基分泌表達(dá)，分子量大小約為39.2kDa，表達(dá)量占總體蛋白的12.7％，分泌蛋白中占16.3％；LL-pNBCL2001向膜錨定表達(dá)14CDTA，表達(dá)產(chǎn)物分子量大小約為55.1kDa，重組蛋白在總體蛋白中占10.1％，占膜蛋白的16.5％。Western-blot結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物可被艱難梭菌A毒素抗體所識(shí)別。 3.破傷風(fēng)

15、毒素C片段乳鏈菌表達(dá)載體的構(gòu)建及與14CDTA在乳鏈菌內(nèi)的融合表達(dá) 采用基因拼接的方法獲得了適應(yīng)于乳鏈菌表達(dá)的TETC基因，構(gòu)建了表達(dá)TETC的重組乳鏈菌LL-pNBCL1002、LL-pNBCL2002及表達(dá)TETC-14CDTA融合蛋白的重組乳鏈菌LL-pNBCL1003、LL-pNBCL2003，SDS-PAGE顯示LL-pNBCL1002總蛋白及上清蛋白有大小約為57.8kDa的表達(dá)蛋白，表達(dá)量占總體蛋白的8.06％、上

16、清蛋白的9.82％，LL-pNBCL2002的總蛋白及膜蛋白有大小約為73.5kDa的表達(dá)蛋白，表達(dá)量占總體蛋白的10.7％、膜蛋白的17.9％；表達(dá)產(chǎn)物可與抗破傷風(fēng)毒素抗體發(fā)生免疫印跡反應(yīng)。 4.重組乳鏈菌對(duì)艱難梭菌感染動(dòng)物模型的保護(hù)作用 空白對(duì)照組在艱難梭菌攻擊后第1天全部出現(xiàn)稀便，攻擊后第2天出現(xiàn)死亡，于第4天該組金黃地鼠全部死亡。 結(jié)論： 1.采用基因拼接的方法拼接了帶有P59啟動(dòng)子、SPusp4

17、5信號(hào)肽基因、多克隆位點(diǎn)的基因PU，隨后構(gòu)建了可分泌表達(dá)外源基因的乳鏈菌表達(dá)質(zhì)粒pNBCL1000及可膜錨定表達(dá)外源基因的乳鏈菌表達(dá)pNBCL2000，并通過(guò)將EGFP基因連接到表達(dá)系統(tǒng)，激光共聚焦顯微鏡觀察，分別在大腸桿菌及乳鏈菌驗(yàn)證了表達(dá)系統(tǒng)。 2.通過(guò)PCR方法擴(kuò)增艱難梭菌羧基末端基因(14CDTA)，構(gòu)建表達(dá)14CDTA的乳鏈菌表達(dá)載體，在乳鏈菌內(nèi)表達(dá)了14CDTA，并通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了表達(dá)產(chǎn)物的抗原活性。

18、3.根據(jù)乳鏈菌密碼子，設(shè)計(jì)了適于乳鏈菌表達(dá)的破傷風(fēng)毒素C片段基因序列(TETC)，并通過(guò)基因拼接的方法拼裝了TETC，構(gòu)建了TETC乳鏈菌表達(dá)載體及TETC-14CDTA融合基因表達(dá)載體，表達(dá)了TETC基因及TETC-14CDTA融合基因，并進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了表達(dá)產(chǎn)物的抗原活性。 4.采用克林霉素誘導(dǎo)，艱難梭菌攻擊制成了艱難梭菌感染的動(dòng)物模型，并通過(guò)該動(dòng)物模型初步驗(yàn)證了重組乳鏈菌活菌疫苗對(duì)艱難梭菌感染的預(yù)防及保護(hù)作用。