海南假單胞菌的致病力及致病機(jī)理研究.pdf

1、目的：2002年海南省人民醫(yī)院谷海瀛教授從一例肺炎患者的痰中分離出1株假單胞新菌種，臨床病例顯示該菌的致病力很強(qiáng)。谷海瀛教授將其命名為海南假單胞(Pseudomonashainanensis，PH)，其基因序列已被GenBank承認(rèn)并接收，接受號為AY120881。該細(xì)菌是引起人類感染的第13個假單胞新菌種。PH的16SrRNA進(jìn)化親緣關(guān)系樹表明，該菌株屬于假單胞菌屬，與銅綠假單胞菌(PA)的親緣關(guān)系最為接近，該菌株有莢膜，而莢膜可能是

2、致病性較強(qiáng)的因素之一。然而，PH的致病性在現(xiàn)尚不清楚。為此，本研究通過動物實(shí)驗(yàn)，建立銅綠假單胞菌與海南假單胞菌慢性感染的動物模型，使其與常見的假單胞菌-銅綠假單胞菌進(jìn)行致病力的比較。通過檢測肺泡灌注液(BALF)中白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α觀測其炎癥反應(yīng)情況，檢測血清中金屬基質(zhì)蛋白酶2(MMP-2)反映肺纖維化的進(jìn)程，從而比較海南假單胞菌與銅綠假單胞菌在致病力方面的差異，對于認(rèn)識這一新

3、菌種致病性有十分重要的意義，并且為由該菌引起的其他病例的診斷和治療提供了科學(xué)依據(jù)。 方法：1實(shí)驗(yàn)動物：雄性昆明小鼠，體重26-32g，購自海南省人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室。2建立支氣管慢性感染的動物模型：85只實(shí)驗(yàn)動物分為四組，A組經(jīng)支氣管接種無菌瓊脂糖珠懸液，B組經(jīng)支氣管接種富含銅綠假單胞菌瓊脂糖珠懸液，C組經(jīng)支氣管接種富含海南假單胞菌瓊脂糖珠懸液，D組作為健康對照組。3分別于接種后1天、2天、3天、5天、7天將小鼠麻醉后，經(jīng)心臟取血

4、，收集血清用于細(xì)胞因子、MMP-2和尿素等成分的檢測；進(jìn)行肺泡灌注，收集回收液，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)；計數(shù)WBC并分類；檢測細(xì)胞因子、MMP-2，并通過尿素稀釋倍數(shù)校正。肺組織用來做病理檢查。4統(tǒng)計學(xué)分析：計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組不同時間標(biāo)本檢測結(jié)果的差異及組間差異用方差分析處理。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均用EXEL及SAS8.0統(tǒng)計學(xué)軟件包分析處理。 結(jié)果：1肺泡灌注液細(xì)菌學(xué)檢測：24只感染PA的小鼠中有21只肺泡灌

5、注液經(jīng)培養(yǎng)分離出PA(感染率為87.5％)；29只感染PH的小鼠中有26只肺泡灌注液經(jīng)培養(yǎng)分離出PH(感染率為89.6％)。然而，僅有1只接種無菌瓊脂的小鼠肺中分離出細(xì)菌，余下陰性。5只未接種小鼠肺泡灌注液細(xì)菌培養(yǎng)陰性。2肺泡灌注液中炎性介質(zhì)水平：感染組(B組與C組)與未感染組(A組)BALF中炎性蛋白介質(zhì)水平有明顯差異(P＜0.05)。BALF中mTNF-α、mIL-1β、mIL-6及mIL-8在接種PH1-2天達(dá)到高峰，在接種PA2

6、-3天達(dá)到高峰，幾乎所有細(xì)胞因子在接種7天后接近正常水平。血中未檢測到mTNF-α、mIL-1β、mIL-6及mIL-8。3泡灌注液中中性粒細(xì)胞數(shù)量：接種PH組中性粒感染2天后百分比最高(大約91％±4.29％)，接種PA組中性粒感染3天后百分比最高(大約87.4％±3.71％)，接種無菌瓊脂小鼠中性粒1天最高(59％±7.6％)。中性粒在BLA中絕對數(shù)量顯示，A組接種無菌瓊脂小鼠BLA中中性粒細(xì)胞絕對值1天后最高。B組峰值在感染PA后

7、3天(878×106±76.9×106cells/mlBLAF)，C組峰值在感染PH后2天(835×106±97.5±106cells/mlBLAF)。4血清中金屬基質(zhì)蛋白酶A(MMP-2)：感染組(B組與C組)與未感染組(A組)血清中金屬基質(zhì)蛋白酶A(MMP-2)水平有明顯差異(P＜0.05)。B組與C組都是在第三天MMP-2水平達(dá)到峰值。5病理學(xué)：無菌組肺病理反應(yīng)為組織柔軟、集中、單核細(xì)胞浸潤，PA與PH感染組在小血管和小支氣管周圍

8、有中性粒細(xì)胞浸潤，這種滲入有些已經(jīng)到達(dá)實(shí)質(zhì)。 結(jié)論：1本實(shí)驗(yàn)成功建立了慢性海南假單胞菌的肺炎動物模型，肺組織在感染的第1天即有炎性改變，大致7天恢復(fù)正常。BALF中分離培養(yǎng)出海南假單胞菌，感染后7天內(nèi)一直存在。2海南假單胞菌引起炎癥反應(yīng)的峰值(1-2天)比銅綠假單胞菌引起的炎癥反應(yīng)的峰值(2-3天)要早，即海南假單胞菌所致病情進(jìn)展較快，分析其原因，可能與海南假單胞菌有外莢膜有關(guān)，我們對此將在以后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。3海南假單胞菌

9、引起炎癥反應(yīng)各項指標(biāo)的峰值與銅綠假單胞菌引起的炎癥反應(yīng)的峰值并無明顯差異(P＞0.05)，提示海南假單胞菌與常見的銅綠假單胞菌所致炎癥反應(yīng)程度大致相當(dāng)。4動物模型循環(huán)系統(tǒng)中檢出金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，海南假單胞菌引起的感染組與銅綠假單胞菌引起的感染組都是在第三天MMP-2達(dá)到峰值，與無菌組有明顯差異(P＜0.05)，但兩組峰值之間并無明顯差異(P＞0.05)，由此推測這兩種假單胞菌在引起慢性阻塞性肺疾病(COPD)的進(jìn)程上大致相同。說