MicroRNA-206在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的意義及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分MicroRNA-206在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的意義及其機(jī)制研究
　　研究目的:
　　通過(guò)慢病毒建立miR-206高表達(dá)和低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞株，研究三組細(xì)胞生物學(xué)特征，探索miR-206在MCF-7細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用;探討4-OH TAM對(duì)三組細(xì)胞的生物學(xué)變化及內(nèi)分泌治療敏感性的改變。
　　研究方法:
　　1．分別構(gòu)建miR-206的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及抑制質(zhì)粒，包裝慢病毒，感染乳腺癌MCF-7細(xì)

2、胞使其穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及低表達(dá)miR-206。
　　2．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MCF-7細(xì)胞、miR-206過(guò)表達(dá)MCF-7和miR-206低表達(dá)MCF-7中miR-206的表達(dá)情況。
　　3．通過(guò)CCK8法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖能力變化，并繪制生長(zhǎng)曲線;劃痕愈合實(shí)驗(yàn)比較三者的細(xì)胞遷移能力;流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。
　　4．以5μM4-OH TAM處理三組細(xì)胞48小時(shí)后，檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖情況并繪制生長(zhǎng)曲線;west

3、ern blot法測(cè)相關(guān)蛋白變化;流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。
　　研究結(jié)果:
　　我們通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立miR-206高表達(dá)MCF-7和miR-206低表達(dá)MCF-7，real-time PCR檢測(cè)到miR-206高表達(dá)MCF-7的miR-206表達(dá)水平較其他兩組高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著時(shí)間的推移，miR-206高表達(dá)MCF-7細(xì)胞的增殖速度較其他兩組細(xì)胞有減慢的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)5μM4-OH TAM處理48小時(shí)

4、或72小時(shí)后，對(duì)照組和加藥組中三組細(xì)胞的遷移能力均未見(jiàn)明顯差別。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到，藥物處理48小時(shí)后，MCF-7和miR-206高表達(dá)MCF-7的凋亡程度比miR-206低表達(dá)MCF-7的凋亡程度高，提示miR-206低表達(dá)MCF-7對(duì)TAM較其他兩組更不敏感。經(jīng)過(guò)藥物處理的MCF-7, miR-206高表達(dá)MCF-7細(xì)胞，p21表達(dá)水平較用約前明顯升高，在miR-206低表達(dá)MCF-7細(xì)胞用藥前后p21表達(dá)水平無(wú)明顯差別;經(jīng)過(guò)藥物處理

5、的miR-206高表達(dá)MCF-7和miR-206低表達(dá)MCF-7細(xì)胞，bcl-2表達(dá)水平較用藥前明顯降低，在MCF-7細(xì)胞其表達(dá)水用約前后無(wú)明顯差別;miR-206高表達(dá)MCF-7的ERα、NRP1、PKCε的表達(dá)水平均比其他兩組細(xì)胞低。
　　結(jié)論:
　　MiR-206可能參與ERα的調(diào)控以及ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的凋亡。MiR-206可能與內(nèi)分泌治療的敏感性有關(guān);與MCF-7和miR-206高表達(dá)MCF-7相比，miR-206

6、低表達(dá)MCF-7對(duì)三苯氧胺的敏感性較差。NRP1、PKCε可能是miR-206的下游調(diào)控基因，這些基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生物學(xué)的影響，值得進(jìn)一步研究。
　　第二部分不同月經(jīng)周期擇期手術(shù)治療對(duì)絕經(jīng)前乳腺癌預(yù)后的影響
　　研究背景:
　　圍手術(shù)期的人體微環(huán)境可能影響微轉(zhuǎn)移灶的生物學(xué)特征，甚至促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。人體微環(huán)境隨著月經(jīng)周期變化而變化。目前，對(duì)于在月經(jīng)周期的不同階段進(jìn)行手術(shù)治療是否會(huì)影響絕經(jīng)前乳腺癌患者的預(yù)后，仍存有不同意

7、見(jiàn)。
　　研究方法:
　　將2000-2002年在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)的554例絕經(jīng)前乳腺癌患者，按手術(shù)時(shí)間及月經(jīng)狀態(tài)分為卵泡期手術(shù)組（患者在月經(jīng)周期第1-14天接受手術(shù)）和黃體期手術(shù)組（患者在月經(jīng)周期第15-31天接受手術(shù)）兩組，同顧性分析影響絕經(jīng)前乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素。單因素生存分析用Kaplan-Meier法估計(jì)，并用時(shí)序檢驗(yàn)(Log-rank test)進(jìn)行組間比較;多因素生存分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型法

8、。P＜0.05為差異有顯著意義。所有統(tǒng)計(jì)處理采用Stata10.0軟件進(jìn)行運(yùn)算。由于不同個(gè)體月經(jīng)周期長(zhǎng)短不同，卵泡期和黃體期的分界值也不同，我們將分別將月經(jīng)周期第10-22天分別作為分界值以排除個(gè)體差異對(duì)臨床結(jié)果的影響。
　　研究結(jié)果:
　　Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型結(jié)果顯示，卵泡期手術(shù)組的無(wú)病生存率(HR=0.318，95％Cl:0.10-0.99，P=0.049)和總生存率（HR=0.260，95％ Cl:0.07-0.92，P

9、=0.036）均高丁黃體期手術(shù)組。當(dāng)卵泡期和黃體期的分界值設(shè)置在月經(jīng)第14、18、19天時(shí)，卵泡期手術(shù)組DFS較黃體期手術(shù)組有明顯改善;當(dāng)分界值設(shè)置在月經(jīng)第11、13、14天時(shí)，卵泡期手術(shù)組OS也有明顯延長(zhǎng)。分界值設(shè)置在月經(jīng)第10-22天時(shí)可見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)比有低幅度波動(dòng)，無(wú)論是DFS還是OS，在月經(jīng)周期第22天以后風(fēng)險(xiǎn)比值上升。
　　結(jié)論:
　　與黃體期手術(shù)組的絕經(jīng)前乳腺癌患者相相比，卵泡期手術(shù)組的的預(yù)后更好。針對(duì)不同患者不同月經(jīng)狀