REGgamma在乳腺癌中的表達特征及其對ERα調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅著患者的健康狀態(tài)和生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計約70％的乳腺癌患者腫瘤組織呈雌激素受體(ERα)陽性狀態(tài)，這類患者在乳腺癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中可表現(xiàn)為雌激素依賴狀態(tài)，因此雌激素及雌激素受體狀態(tài)的調(diào)控對這類患者顯得更加重要。蛋白酶體調(diào)控子/共激活因子REGgamma參與乳腺癌、甲狀腺癌、肝細胞癌、結(jié)直腸癌等多個人體惡性腫瘤病理、生理過程，文獻報道REGgamma可以對腫瘤基因、抑癌基因及其蛋白表達產(chǎn)物發(fā)

2、揮調(diào)控作用。REGgamma在人乳腺癌領域的研究報道數(shù)量非常稀少，目前我們對REGgamma在乳腺癌疾病過程中可能發(fā)揮作用的認識尚不明確。因此值得對REGgamma的生物學功能進行深入探索，這不僅是對現(xiàn)有REGgamma生物學功能理論、知識體系的有益補充，也可能為提高乳腺癌臨床治療效果提供新的切入點，為乳腺癌的診斷及治療提供新的幫助。
　　1.REGgamma在乳腺癌組織中高表達，REGgamma高表達狀態(tài)與乳腺癌轉(zhuǎn)移及不良臨床預

3、后正相關(guān)
　　目的:探索REGgamma在人乳腺疾病患者乳腺組織及腋窩淋巴結(jié)組織中的表達特征，分析REGgamma不同表達狀態(tài)與乳腺癌患者的病理學特征及臨床預后之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法:使用免疫組織化學(IHC)技術(shù)和免疫印跡(Western blot)技術(shù)，在136例乳腺癌患者和140例乳腺良性疾病患者組織標本中研究REGgamma表達特征。
　　結(jié)果:1.REGgamma在人乳腺癌組織中高表達。136例乳腺癌標本中1

4、11例(81.6％)REGgamma呈陽性表達，其表達率顯著性高于乳腺良性疾病(9/140，6.4％，p＜0.001)，低于乳腺癌轉(zhuǎn)移腋窩淋巴結(jié)組織(116/116，100％，p＜0.001)。2.REGgamma陽性表達與乳腺癌患者較差的臨床病理學特征相關(guān)聯(lián)。我們研究發(fā)現(xiàn)REGgamma表達與下列因素無關(guān):發(fā)病年齡(p=0.702)、月經(jīng)狀態(tài)(p=0.171)、孕激素受體progesterone receptor(PR)表達狀態(tài)(p=

5、0.211)以及人表皮生長因子受體-2human epidermal growth factor receptor-2(HER-2)表達狀態(tài)(p=0.557)。但是REGgamma高表達與乳腺腫瘤的大小(p＜0.001)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(p＜0.001）、腫瘤TNM分級(p=0.038)、組織學分化程度(p=0.001）和雌激素受體(ERα)表達狀態(tài)(p＜0.001)正相關(guān)。3.REGgamma高表達與乳腺癌患者不良臨床預后正相關(guān)。

6、乳腺癌患者5年生存分析(OS和DFS)結(jié)果提示:REGgamma低表達乳腺癌患者生存率顯著性高于REGgamma高表達患者(p＜0.05），Cox多因素回歸分析的結(jié)果顯示REGgamma可能作為評估乳腺癌患者預后新的獨立預測因子(OR=4.369，p=0.008)。
　　結(jié)論:REGgamma在乳腺癌組織和腋窩癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達，REGgamma高表達與乳腺癌患者較差臨床病理學特征以及不良預后正相關(guān)。
　　2.MMTV-P

7、yMT小鼠是研究乳腺癌活體中REGgamma表達模式理想動物模型
　　目的:使用MMTV-PyMT人乳腺癌小鼠動物模型研究REGgamma在乳腺癌動物體內(nèi)的表達特征。
　　方法:使用免疫組織化學染色、免疫印跡等方法比較REGgamma在MMTV-PyMT(FVB/N-Tg MMTV-PyVT634Mul/J mice)乳腺癌小鼠動物模型和FVB(FVB/NJ，nontransgenic)對照小鼠乳腺癌組織、正常乳腺組織以及肺

8、轉(zhuǎn)移癌組織、正常肺組織之間表達的差異性。
　　結(jié)果:1.REGgamma在MMTV-PyMT小鼠乳腺癌和肺轉(zhuǎn)移癌組織中呈高表達。20只MMTV-PyMT小鼠中14只(70％)乳腺癌組織中REGgamma呈陽性表達，其表達率顯著性高于FVB對照小鼠正常乳腺組織(0/20，0％，p＜0.001)，低于MMTV-PyMT小鼠肺轉(zhuǎn)移癌組織(20/20，100％，p=0.027)。2.免疫印跡檢測顯示FVB正常對照小鼠乳腺組織和肺組織中均未

9、見REGgamma蛋白表達，MMTV-PyMT小鼠乳腺癌組織(p=0.0051)和肺轉(zhuǎn)移癌組織(p=0.0190)中REGgamma蛋白均呈高表達。3.20只MMTV-PyMT小鼠(REGgamma高/低表達組各10只)的生存分析研究顯示，REGgamma高表達的小鼠生存率(OS)顯著性低于REGgamma低表達的小鼠。
　　結(jié)論:MMTV-PyMT小鼠是人乳腺癌疾病過程的近似模擬，是研究REGgamma在乳腺癌動物體內(nèi)表達的理想

10、動物模型。REGgamma的表達水平可以反映MMTV-PyMT乳腺癌荷瘤小鼠的生存預后。
　　3.REGgamma對人乳腺癌細胞增殖能力、運動能力和侵襲能力的影響
　　目的:探索REGgamma對ERα陽性人乳腺癌MCF7和BT474細胞增殖能力、運動能力和侵襲能力的影響。
　　方法:使用小RNA干擾(siRNA)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、細胞增殖檢測技術(shù)(MTS)、細胞活動性檢測技術(shù)以及侵襲小室檢測技術(shù)(transwell

11、)，比較REGgamma-siRNA處理前后人乳腺癌MCF7和BT474細胞表型的差異。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過REGgamma-siRNA處理，乳腺癌MCF7(p=0.0033)和BT474(p=0.0114)細胞增值能力顯著性下降。2.經(jīng)過REGgamma-siRNA處理后，人乳腺癌MCF7(p＜0.0001)和BT474(p＜0.0001)細胞活動能力顯著性降低。3.經(jīng)過REGgamma-siRNA處理，乳腺癌細胞侵襲能力較對照

12、組細胞顯著性下降。MCF7細胞侵襲性由86.72％下降至24.84％，侵襲指數(shù)(invasion index)為0.2864; BT474細胞侵襲性由59.65％下降至23.43％，侵襲指數(shù)為0.3928。
　　結(jié)論:乳腺癌細胞MCF7和BT474經(jīng)過REGgamma基因下調(diào)處理后，細胞增殖能力、移動能力和侵襲能力均呈顯著性下降，提示REGgamma可能具有促進乳腺癌細胞惡性進展的潛能。
　　4.REGgamma通過泛素-蛋

13、白酶體途徑調(diào)控ERα蛋白表達
　　目的:在乳腺癌MCF7和BT474細胞中探索REGgamma對ERα表達調(diào)控可能的機制。
　　方法:使用小RNA干擾技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、Real-time PCR定量分析技術(shù)、ERα蛋白半衰期檢測技術(shù)及ERα-ubiquitin免疫共沉淀分析等技術(shù)手段，在人乳腺癌MCF7和BT474細胞中檢測REGgamma對ERα表達的調(diào)控機制。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過REGgamma-siRNA處理，

14、MCF7(p=0.0108)和BT474(p=0.0065)細胞內(nèi)ERα蛋白表達水平顯著性下降，但是MCF7(p=0.3011)和BT474(p=0.2178)細胞內(nèi)ERα轉(zhuǎn)錄mRNA表達水平未發(fā)生明顯變化(p＞0.05）。2.經(jīng)過REGgamma-siRNA處理，ERα陽性人的乳腺癌細胞ERα蛋白半衰期(half-life time)顯著縮短(REGgamma-siRNA處理后細胞的半衰期約2小時，control-siRNA對照組細胞

15、的半衰期約4小時)。REGgamma-siRNA處理后，MCF7(p=0.0093)和BT474(p=0.0155)細胞中ERα蛋白降解速度顯著性加快。3.蛋白酶體抑制劑MG132可以完全阻斷REGgamma對ERα蛋白的降解的調(diào)控作用。4.ERα-ubiquitin免疫共沉淀分析結(jié)果顯示:REGgamma可能通過泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控ERα蛋白的降解。REGgamma可以發(fā)揮類似ERα穩(wěn)定劑樣作用，抑制人乳腺癌MCF7和BT474細胞