高血糖所致O-GlcNAc糖基化修飾減弱胰島素對(duì)缺血-再灌注心肌的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：
　　作為一種輔助治療措施，極化液“葡萄糖-胰島素-鉀”（GIK）用于急性心肌梗死（AMI）和心臟外科手術(shù)的臨床治療已有50多年的歷史，但其療效一直存在爭(zhēng)議。對(duì)這些臨床試驗(yàn)的研究結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GIK治療組患者血糖顯著升高可能是導(dǎo)致試驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果的重要原因之一。我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可加重大鼠和犬心肌缺血/再灌注損傷，且明顯減弱GIK對(duì)缺血/再灌注心肌的保護(hù)作用。這些結(jié)果提示，良好的血糖控制是GIK臨床應(yīng)用的重

2、要前提，但是高血糖減弱GIK心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚不清楚。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)，胰島素是GIK發(fā)揮心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵成分；胰島素可通過(guò)結(jié)合胰島素受體（IR）促進(jìn)胰島素受體底物-1（IRS-1）酪氨酸磷酸化，激活3-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B-內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）途徑抑制缺血／再灌注心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌生存，防治遲發(fā)性心肌梗死。據(jù)此提出胰島素直接激活細(xì)胞“生存信號(hào)（survival signal）”的細(xì)

3、胞保護(hù)新機(jī)制。另一方面，近年的研究顯示高血糖對(duì)細(xì)胞的損傷作用與葡萄糖的已糖胺生物合成通路（HBP）密切相關(guān)。尿嘧啶-5’-二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）作為HBP的終產(chǎn)物，在O-連接N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）糖基化轉(zhuǎn)移酶（OGT）的作用下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高。然而，蛋白質(zhì) O-GlcNAc糖基化修飾（O-GlcNAcylation）的作用位點(diǎn)往往是已知相同或相近的磷酸化位點(diǎn)，因此 O-G

4、lcNAc糖基化可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)其修飾位點(diǎn)從而影響重要信號(hào)蛋白分子的磷酸化水平。那么，高血糖是否可通過(guò)O-GlcNAc糖基化修飾影響胰島素“生存信號(hào)”中關(guān)鍵信號(hào)分子的活性，進(jìn)而影響胰島素對(duì)缺血/再灌注心肌的保護(hù)作用呢？因此，我們擬進(jìn)一步研究高血糖減弱胰島素對(duì)缺血/再灌注心肌保護(hù)作用的機(jī)制，尤其是 O-GlcNAc糖基化修飾在其中的關(guān)鍵作用，期望對(duì)GIK及胰島素在急性心肌梗死和心臟外科危重患者的臨床應(yīng)用中提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。
　　研究目

5、的：
　　1、探討高血糖減弱胰島素對(duì)缺血/再灌注心肌保護(hù)作用的機(jī)制，尤其是IRS-1和Akt的O-GlcNAc糖基化和磷酸化修飾在其中的關(guān)鍵作用。
　　2、探討心臟外科手術(shù)患者體外循環(huán)缺血/再灌注過(guò)程中血糖與GIK心肌保護(hù)作用的關(guān)系及其機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、利用酶消化法分離和培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞。穩(wěn)定培養(yǎng)24h后乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別給予以下處理：（1）對(duì)照組（Control）；（2）Manni

6、tol組（5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇）；（3）正常糖組（5.5 mmol/L葡萄糖，NG）；（4）高糖組（33 mmol/L葡萄糖，HG）；（5）NG+Ins（5.5 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰島素）；（6）HG+Ins（33 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰島素）。分別作用48 h，后五組給予缺氧/復(fù)氧處理（置于95％N2、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧4 h，95%O2、5%CO2

7、細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧2 h）。
　　2、采用谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶（GFAT）抑制劑6-重氮-5-氧代正亮氨酸（DON）對(duì)原代乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行處理，分組如下（1）NG+Ins（5.5 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰島素）；（2）HG+Ins（33 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰島素）；（3）HG+Ins+DON（33 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰島素+40μmol/L DON），常規(guī)培養(yǎng)

8、48 h后給予缺氧/復(fù)氧（4 h/2 h）處理。
　　3、采用MTT測(cè)定法檢測(cè)乳鼠心肌細(xì)胞存活率；收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）的活性以評(píng)估細(xì)胞損傷程度；采用Annexin V-FITC和PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。
　　4、我們與西京醫(yī)院心臟外科合作開(kāi)展了二尖瓣置換手術(shù)患者體外循環(huán)圍術(shù)期 GIK治療的隨機(jī)對(duì)照臨床研究，分別在麻醉誘導(dǎo)前給患者輸注平衡鹽溶液或GIK（200 g/L glucose,

9、66.7 U/L insulin and80 mmol/L KCl），速度為60ml/h，時(shí)間持續(xù)12.5小時(shí)。
　　5、分別于術(shù)前、體外循環(huán)5 min、主動(dòng)脈阻閉5 min、主動(dòng)脈開(kāi)放5 min、術(shù)后1 h、術(shù)后6 h、術(shù)后12 h、術(shù)后24 h以及術(shù)后48 h采取血樣，測(cè)定血糖濃度；檢測(cè)患者術(shù)前及術(shù)后6 h、24 h、48 h的血漿肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白I（cTnI）含量變化，用于評(píng)估心臟外科手術(shù)患者體外循環(huán)誘

10、導(dǎo)的心肌損傷程度及不同組別對(duì)心肌損傷的影響。
　　6、采用免疫沉淀法（IP）和Western Blot分別檢測(cè)離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞及體外循環(huán)患者主動(dòng)脈開(kāi)放15 min后心肌組織中胰島素信號(hào)分子IRS-1、Akt的O-GlcNAc糖基化和磷酸化水平。
　　研究結(jié)果：
　　1、與正常葡萄糖培養(yǎng)組相比，高糖培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞的存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡和壞死增加（HG vs. NG，n=8，P﹤0.05）。與對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)

11、氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡和壞死增加；胰島素干預(yù)可顯著抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞存活（NG+Ins vs. NG，n=8，P﹤0.05）；而高糖存在情況下乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷進(jìn)一步加重。不僅如此，高糖培養(yǎng)還可削弱胰島素對(duì)心肌細(xì)胞的上述保護(hù)作用（HG+Ins vs. NG+Ins，n=8，P﹤0.01）。
　　2、與正常糖培養(yǎng)組相比，高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總 O-GlcNAc糖基化水平及IRS-1 O-

12、GlcNAc糖基化水平顯著增加（HG vs. NG，n=4，P﹤0.01）；在高糖存在時(shí)胰島素處理組IRS-1的O-GlcNAc糖基化水平明顯增加（HG+Ins vs. NG+Ins，P﹤0.01，n=4）；與正常糖培養(yǎng)組相比，胰島素干預(yù)導(dǎo)致IRS-1和Akt磷酸化水平增加（NG+Ins vs. NG，n=4，P﹤0.01）；而高糖培養(yǎng)條件下，胰島素誘導(dǎo)的IRS-1磷酸化水平降低45%，Akt磷酸化水平下降40%（HG+Ins vs.

13、NG+Ins，n=4，P﹤0.01）。上述結(jié)果提示，高糖可增加胰島素信號(hào)蛋白IRS-1的O-GlcNAc糖基化水平，同時(shí)降低胰島素誘導(dǎo)的IRS-1、Akt的磷酸化水平。
　　3、為進(jìn)一步明確 O-GlcNAc糖基化修飾在減弱胰島素心肌保護(hù)效應(yīng)中所發(fā)揮的作用，采用已糖胺生物合成通路的限速酶GFAT的抑制劑DON對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示：DON降低高糖誘導(dǎo)的IRS-1 O-GlcNAc糖基化水平，同時(shí)增加IRS-1、Akt的磷酸

14、化水平（HG+Ins+DON vs. HG+Ins，n=4，P﹤0.05）；阻斷高糖對(duì)胰島素心肌細(xì)胞保護(hù)作用的抑制效應(yīng)，心肌細(xì)胞的存活率增加，心肌細(xì)胞凋亡與壞死減少（HG+Ins+DON vs. HG+Ins，n=8，P﹤0.05）。
　　4、根據(jù)術(shù)中血糖水平，將患者分為以下四組：（1）對(duì)照組（輸注平衡鹽溶液，術(shù)中血糖＜200mg/dL，Control-NG），n=7；（2）高血糖對(duì)照組（輸注平衡鹽溶液，但術(shù)中血糖≥200mg/d

15、L，Control-HG），n=7；（3）GIK組（輸注 GIK，術(shù)中血糖＜200mg/dL，GIK-NG），n=9；（4）高血糖 GIK組（輸注 GIK溶液，但術(shù)中血糖≥200mg/dL，GIK-HG），n=11。與對(duì)照組相比，高血糖對(duì)照組血清中CK-MB、cTnI釋放量明顯升高（Control-HG vs. Control-NG，P<0.01）；與GIK組相比，高血糖GIK組血清中的CK-MB、cTnI釋放顯著增加(GIK-HG v

16、s. GIK-NG，P<0.01)。提示體外循環(huán)過(guò)程中高血糖加重心肌損傷，同時(shí)削弱 GIK對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。
　　5、與對(duì)照組相比，GIK治療使患者心肌組織中IRS-1 Tyr Y608磷酸化水平和Akt Ser473磷酸化水平顯著升高（GIK-NG vs. Control-NG，n=4，P<0.01）；高血糖可誘導(dǎo)心肌組織內(nèi)蛋白質(zhì)的總O-GlcNAc糖基化修飾水平顯著提高、IRS-1及Akt的O-GlcNAc糖基化修飾水平顯

17、著升高（Control-HG vs. Control-NG；n=4，P均<0.01）；同時(shí)抑制 GIK誘導(dǎo)的 IRS-1 Tyr Y608磷酸化和Akt Ser473磷酸化（GIK-HG vs. GIK-NG，n=4，P<0.01）。上述結(jié)果提示，GIK治療可激活胰島素“生存信號(hào)”，促進(jìn) IRS-1及 Akt的磷酸化；體外循環(huán)過(guò)程中出現(xiàn)的高血糖可導(dǎo)致IRS-1及Akt O-GlcNAc糖基化修飾水平增加，同時(shí)磷酸化水平降低，減弱GIK對(duì)