O-GlcNAc糖基化在神經(jīng)疾病中的作用.pdf

1、第一部分 O-GlcNAc糖基化對(duì)Insulin-PI3K-AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　 目的：在不同細(xì)胞中研究O-GlcNAc糖基化對(duì)Insulin-P13K-AKT信號(hào)通路的影響。
　　 方法：在HEK-293FT，HepG2，N2a細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元過表達(dá)或下調(diào)O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶OGT，或使用調(diào)節(jié)O-GlcNAc糖基化修飾關(guān)鍵酶的抑制劑處理細(xì)胞，改變細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化水平。利用免疫共沉淀

2、的方法研究Insulin-PI3K-AKT信號(hào)通路中可以被O-GlcNAc糖基化的組成部分。采用蛋白免疫印跡技術(shù)分析不同細(xì)胞內(nèi)O-GIcNAc糖基化對(duì)AKT和GSK-3β磷酸化和活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1)在HEK-293FT細(xì)胞中，免疫共沉淀和蛋白免疫印跡分析顯示，AKT和GSK-3β是Insulin-PI3K-AKT信號(hào)通路中受O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白。
　　 2)在不同培養(yǎng)條件下，改變HE

3、K-293FT細(xì)胞的O-GlcNAc糖基化水平，影響PI3K-AKT信號(hào)通路。O-GlcNAc糖基化負(fù)性調(diào)控AKT的Thr308和Ser473磷酸化水平，改變其活性。降低細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化，下調(diào)GSK-3β的Ser9的磷酸化，但升高細(xì)胞內(nèi)的O-GlcNAc糖基化對(duì)GSK-3β的Ser9磷酸化沒有影響
　　 3)在不同培養(yǎng)條件下，改變HepG2細(xì)胞的O-GlcNAc糖基化水平，對(duì)AKT的GSK-3β的磷酸化沒有明顯的影響

4、。
　　 4)N2a細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元，O-GIcNAc糖基化調(diào)節(jié)AKT的磷酸化，但對(duì)GSK-3β的磷酸化沒有影響。
　　 結(jié)論：
　　 本研究顯示O-GlcNAc糖基化對(duì).AKT和GSK-3β的調(diào)節(jié)具有蛋白特異性和細(xì)胞特異性。Insulin-PI3K-AKT在不同的器官、組織和細(xì)胞中，扮演著不同的角色，O-GlcNAc糖基化的調(diào)節(jié)也存在著不同的表現(xiàn)，在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，O-GlcNAc糖基化調(diào)節(jié)AKT的

5、活性。
　　 第二部分 O-GlcNAc糖基化在腦缺血中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：研究O-GlcNAc糖基化是否及如何引起細(xì)胞凋亡，探討腦缺血早期升高的O-GlcNAc糖基化對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：蛋白質(zhì)免疫印跡和組織免疫熒光染色分析小鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(MiddleCerebral Artery Occlusion，MCAO)腦缺血模型不同時(shí)間O-GlcNAc糖基化改變和AKT的磷酸化水平。Caspa

6、se3的活性測(cè)定和Tunel測(cè)定檢測(cè)小鼠腦缺血早期海馬細(xì)胞發(fā)生凋亡情況。在培養(yǎng)的HEK-293FT細(xì)胞，過表達(dá)OGT或者shOGT下調(diào)OGT表達(dá)以改變細(xì)胞內(nèi)O-GIcNAc糖基化水平，用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，熒光染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)，AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，蛋白質(zhì)免疫印跡分析早期凋亡標(biāo)志Caspase3的活化和PAPR的水解。利用免疫沉淀，定點(diǎn)突變，蛋白免疫印跡分析O-GlcNAc糖基化對(duì)AKT的影響，探討O-Glc

7、NAc糖基化是否通過調(diào)節(jié)AKT影響細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 1)蛋白質(zhì)免疫印跡和組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，小鼠MCAO模型腦缺血早期海馬組織O-GlcNAc糖基化升高，Caspase3活性增加，Tunel染色出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。
　　 2)HEK293FT細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)OGT，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞核濃縮，斷裂，呈現(xiàn)凋亡樣改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到更多的凋亡細(xì)胞，蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化，

8、Caspase3激活，PARP蛋白被水解。
　　 3)AKT的Thr308和Ser473受O-GlcNAc糖基化修飾。過表達(dá)OGT升高O-GlcNAc糖基化，促進(jìn)AKT的糖基化，下調(diào)AKT的活性，引起下游底物Bad磷酸化下降，進(jìn)而活化Caspase3而引起細(xì)胞凋亡；過表達(dá)AKT，可以改善過表達(dá)OGT引起的細(xì)胞凋亡，但過表達(dá)AKT的突變體，則不能逆轉(zhuǎn)OGT引起的細(xì)胞凋亡。
　　 4)缺血海馬的O-GlcNAc糖基化水平和A

9、KT磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)。免疫沉淀AKT，缺血側(cè)海馬AKT的O-GlcNAc糖基化要比對(duì)照側(cè)高。
　　 結(jié)論：AKT的Thr308和Ser473受磷酸化和糖基化雙重修飾。在腦缺血的早期，由于應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的O-GlcNAc糖基化增加，而使AKT的磷酸化及活性下降，磷酸化的BAD減少，經(jīng)過系列反應(yīng)，進(jìn)而激活Caspase3，啟動(dòng)凋亡發(fā)生。因此，O-GlcNAc糖基化在腦缺血早期的細(xì)胞凋亡中可能起重要作用。
　　 第三部分阿

10、爾茨海默病患者腦內(nèi)下調(diào)的O-GlcNAc糖基化影響FOXO1介導(dǎo)的自噬和Tau病變
　　 目的：研究O-GIcNAc糖基化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，探討阿爾茨海默病患者腦內(nèi)下調(diào)的O-GlcNAc糖基化對(duì)FoxO1介導(dǎo)的tau病變的影響。
　　 方法：在HEK-293FT細(xì)胞過表達(dá)OGT或者shOGT下調(diào)OGT的表達(dá)，蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)O-GlcNAc糖基化對(duì)FoxO1的影響。利用蛋白合成和降解的抑制劑處理細(xì)

11、胞，蛋白質(zhì)免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR研究O-GlcNAc糖基化調(diào)節(jié)FoxO1蛋白水平的途徑。利用免疫沉淀技術(shù)研究FoxO1是否被O-GlcNAc糖基化修飾，及如何影響自身的降解。蛋白免疫印跡分析細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中FoxO1，研究O-GlcNAc糖基化改變是否影響FoxO1的細(xì)胞分布。改變細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化水平，檢測(cè)FoxO1報(bào)告基因的熒光素酶活性，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FoxO1靶基因的表達(dá)，蛋白免疫印跡檢測(cè)FoxO1對(duì)自噬的影響，研

12、究O-GIcNAc糖基化改變是否影響FoxO1的活性。利用前腦神經(jīng)元特異性敲除OGT小鼠，蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)O-GlcNAc糖基化改變，AKT和foxO1的蛋白和磷酸化水平，以及自噬和蛋白酶體相關(guān)蛋白的水平，One trail物體識(shí)別，Morris水迷宮，Reversal Morris水迷宮檢測(cè)OGTKO小鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化。蛋白免疫印跡和免疫熒光染色分析AD患者腦內(nèi)O-GlcNAc糖基化和FoxO1的蛋白水平，自噬相關(guān)蛋白水平，以及

13、Tau的聚積。
　　 結(jié)果：
　　 1)改變HEK-293FT細(xì)胞的O-GlcNAc糖基化，不僅通過調(diào)節(jié)AKT的活性，而影響FoxO1蛋白的磷酸化水平，還改變FoxO1的蛋白水平。
　　 2)升高的O-GlcNAc糖基化抑制FoxO1經(jīng)過泛素-蛋白酶體通路進(jìn)行降解。
　　 3)FoxO1本身可以被O-GIcNAc糖基化修飾，當(dāng)O-GlcNAc糖基化修飾增加后，自身的泛素化減少，經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑的降解受

14、到抑制。
　　 4)FoxO1的O-GlcNAc糖基化使得其轉(zhuǎn)錄活性增加，所調(diào)控的自噬功能增強(qiáng)，但不影響其細(xì)胞內(nèi)分布。
　　 5)前腦神經(jīng)元特異性敲除OGT的小鼠，O-GlcNAc糖基化和FoxO1水平均下降，其自噬功能下調(diào)。短時(shí)程和場(chǎng)景記憶能力下降。
　　 6)AD患者腦內(nèi)O-GlcNAc糖基化水平、FoxO1的蛋白水平、P62蛋白水平的增加和LC3的下降提示自噬能力降低，AD腦內(nèi)，F(xiàn)oxO1的蛋白水平與Tau