缺血后處理對大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　缺血后處理(ischemic postconditioning，IPO)是指心肌缺血后，在接受長時(shí)間再灌注之前給予的一組反復(fù)、短暫的再灌注/缺血循環(huán)，這種處理可以明顯減輕心肌再灌注損傷。研究證明，大鼠心臟左冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎造成缺血30 min，給予缺血/再灌注處理(10 s/10 s)5個(gè)循環(huán)后處理，隨后恢復(fù)冠脈血流，能使大鼠的心肌梗死面積較對照組明顯減少。但是關(guān)于缺血后處理的研究大都集中在再灌注早期（再灌

2、注3～6 h），在再灌注24 h缺血后處理是否具有心肌保護(hù)作用的相關(guān)研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建心肌缺血再灌注及缺血后處理大鼠模型，觀察在再灌注24 h的心肌梗死面積以及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)分子的改變，旨在探討缺血后處理心肌保護(hù)作用的時(shí)間窗及其相應(yīng)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　選取體質(zhì)量220-250 g的健康雄性Wistar大鼠126只，隨機(jī)均分為7組，每組18只大鼠又根據(jù)再灌注時(shí)間不同分為兩個(gè)小組（再灌注3

3、h、24h; n=9）。①缺血再灌注組（I/R組）:左冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎缺血30 min，然后直接恢復(fù)再灌注;②缺血后處理組（IPO組）:30 min LAD缺血，持續(xù)性再灌注前給予5個(gè)循環(huán)的缺血/再灌注后處理(10 s/10 s);③缺血后處理+1400W(iNOS抑制劑)組（IPO+1400W組）:缺血后處理前5 min給予大鼠尾靜脈注射1400W(1 mg/kg);④缺血再灌注+1400W組（I/R+1400W組）:直接

4、恢復(fù)再灌注前5 min尾靜脈給予大鼠1400W(1 mg/kg);⑤缺血后處理+LY294002（PI3K阻斷劑）組（IPO+LY294002組）:缺血后處理前5 min給予大鼠尾靜脈注射LY294002(0.3mg/kg);⑥缺血再灌注+LY294002組（I/R+LY294002組）:直接恢復(fù)再灌注前5min尾靜脈給予大鼠LY294002(0.3 mg/kg);⑦假手術(shù)組（Sham）:LAD只穿線，不結(jié)扎，其余手術(shù)步驟與其他組別大鼠

5、一致。在再灌注3h和24 h，每組分別隨機(jī)選取3只大鼠做心肌切片進(jìn)行TTC染色，用于測量梗死面積。剩余的老鼠留取血清標(biāo)本及組織標(biāo)本，采用Elisa方法檢測血清肌酸激酶(CK)活性，免疫組織化學(xué)染色法檢測心肌組織p-Akt的蛋白表達(dá)水平，Western blot法檢測p-Akt及iNOS的表達(dá)。采用SPSS16.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.心肌梗死面積測定:Sham組大鼠無明顯心肌梗死。在再灌注3h和2

6、4 h，與I/R組相比，IPO組均顯著減少了心肌梗死面積，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);再灌注24 h與再灌注3h相比，I/R組和IPO組的梗死面積均增大。在再灌注24 h，iNOS抑制劑(1400W)和PI3K阻斷劑(LY294002)均能阻斷IPO保護(hù)心肌的作用，即:I/R組、IPO+1400W組、IPO+LY294112組梗死面積無顯著組間差異(p＞0.05)。
　　2.血清CK的活性:缺血前，各組大鼠血清CK活性

7、無明顯差異。在再灌注24 h，缺血后處理顯著降低CK活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。但是，iNOS抑制劑1400W完全抑制了IPO的保護(hù)作用，即IPO+1400W組與I/R組CK活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.缺血心肌組織p-Akt表達(dá):假手術(shù)組中，p-Akt蛋白的表達(dá)量很低。在再灌注3h，IPO組p-Akt的表達(dá)比I/R組p-Akt的表達(dá)高6倍(p＜0.05)，LY294002能夠阻斷后處理保護(hù)性激活A(yù)kt的作用;但

8、是，在再灌注24 h， IPO組與I/R組p-Akt的表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。
　　4.缺血心肌組織iNOS的表達(dá):在再灌注24 h，與I/R組相比，IPO組iNOS的表達(dá)顯著增高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); PI3K阻斷劑LY294002能阻斷后處理升高iNOS表達(dá)的作用。在再灌注3h，iNOS的表達(dá)組間無明顯差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　心肌缺血再灌注24 h，IPO仍具有心肌保護(hù)作用