蛋白質(zhì)o-GlcNAc糖基化在紫杉醇抗腫瘤活性中的作用研究.pdf

1、O-GlcNAc糖基化修飾是指單個(gè)的N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以O(shè)-糖苷鍵連接在蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸的羥基的氧原子上。美國(guó)生物化學(xué)家Gerald W.Hart教授課題組1984年首次發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc單糖基化修飾現(xiàn)象。近30年的研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯及加工、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的調(diào)控。O-GlcNAc糖基化的異常修飾可以導(dǎo)致多

2、種疾病，比如腫瘤、糖尿病及多種神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生。而我們?cè)谘芯孔仙即伎鼓[瘤過程中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化水平發(fā)生明顯的改變而且變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。因此，本論文研究蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾在紫杉醇抗腫瘤活性中的作用。
　　本課題主要通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，從動(dòng)物組織和細(xì)胞水平上分析紫杉醇對(duì)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾水平的影響，通過運(yùn)用OGA和OGT的抑制劑研究O-GlcNAc糖基化變化對(duì)紫杉醇抗腫瘤活性的

3、影響，并通過對(duì)O-GlcNAc糖基化生物合成途徑中的相關(guān)酶的影響來分析探討其機(jī)制。此外，本課題還通過質(zhì)譜分析的方法對(duì)糖酵解過程中兩個(gè)關(guān)鍵酶己糖激酶2型(HK2)和丙酮酸激酶M2型(PKM2)的O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，運(yùn)用細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建HK2和PKM2基因穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，構(gòu)建HK2和PKM2基因沉默的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，為進(jìn)一步深入研究O-GlcNAc糖基化修飾的功能作用奠定基礎(chǔ)。
　　在體外細(xì)胞

4、實(shí)驗(yàn)中，通過Western blotting方法檢測(cè)不同濃度的紫杉醇對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及相關(guān)蛋白酶的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化、OGA及OGT的表達(dá)水平隨著紫杉醇濃度的升高而升高，具有濃度依賴性關(guān)系，而相關(guān)的蛋白酶PFK1、HK2、PKM2、GFAT1和GLUT1表達(dá)水平無(wú)明顯變化;通過RT-qPCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OGT和OGA的mRNA表達(dá)水平也隨著紫杉醇濃度的增加而升高，具有濃

5、度依賴性關(guān)系。Westernblotting法檢測(cè)紫杉醇處理MDA-MB-231細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及相關(guān)蛋白酶的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾、OGA、OGT的表達(dá)水平隨著紫杉醇作用時(shí)間的增加而升高而且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，而相關(guān)的蛋白酶PFK1、PKM2、GFAT1和GLUT1表達(dá)水平無(wú)明顯變化?；酋Ａ_丹明B(sulforhodamine B，SRB)比色法測(cè)定OGA抑制劑TMG或PUGNAc單獨(dú)

6、或聯(lián)合紫杉醇對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增值抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMG及PUGNAc對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231無(wú)顯著的增值抑制作用，TMG或PUGNAc與紫杉醇聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞的增值抑制作用與紫杉醇單獨(dú)處理組無(wú)明顯的差異;Western blotting研究發(fā)現(xiàn)TMG或PUGNAc實(shí)驗(yàn)組O-GlcNAc糖基化水平比對(duì)照組高，TMG或PUGNAc與紫杉醇聯(lián)合用藥組的O-GlcNAc糖基化水平比紫杉醇單獨(dú)給藥組高，但OGT的表達(dá)

7、水平卻無(wú)明顯變化規(guī)律。由TMG或PUGNAc對(duì)紫杉醇的細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMG或PUGNAc所引起的O-GlcNAc糖基化水平的增高不影響紫杉醇對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。OGT的抑制劑alloxan與紫杉醇單獨(dú)或聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，SRB結(jié)果顯示alloxan濃度為0-5 mM時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231無(wú)明顯的增殖抑制作用，alloxan與紫杉醇聯(lián)合使用組對(duì)細(xì)胞的增值抑制作用與紫杉醇單獨(dú)加藥組相比無(wú)明顯差異;W

8、estemblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)alloxan處理組的O-GlcNAc糖基化水平降低，而OGA和OGT表達(dá)水平無(wú)明顯的變化。由alloxan對(duì)紫杉醇的細(xì)胞增殖抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明alloxan所引起的O-GlcNAc糖基化水平的降低不影響紫杉醇對(duì)細(xì)胞的增值抑制作用。經(jīng)Westem blotting方法檢測(cè)紫杉醇對(duì)OGA和OGT表達(dá)分布的影響，發(fā)現(xiàn)紫杉醇作用下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)OGA和OGT的表達(dá)水平明顯增高。本課題還通過檢測(cè)紫杉醇處理p53野生

9、型HCT116細(xì)胞和p53基因敲除的HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p53基因的缺失導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化水平升高，并且發(fā)現(xiàn)p53參與紫杉醇誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化改變。為進(jìn)一步研究紫杉醇對(duì)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平影響機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　在體內(nèi)荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)中，通過Western blotting方法檢測(cè)腫瘤組織及肝臟組織中蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化及OGA和OGT的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給藥劑量下紫杉醇沒有影響腫瘤組織和肝臟組

10、織中O-GlcNAc糖基化、OGA和OGT的表達(dá)水平。
　　為了深入研究紫杉醇對(duì)蛋白質(zhì)O-GlcNAc的影響機(jī)制，我們還進(jìn)行了糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶HK2和PKM2的糖基化位點(diǎn)鑒定等相關(guān)工作。本課題通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀的方法富集HK2和PKM2蛋白，之后通過膠內(nèi)酶解等方法進(jìn)行預(yù)處理之后，經(jīng)質(zhì)譜方法分析鑒定了其O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)。結(jié)果在蛋白質(zhì)HK2檢測(cè)到3個(gè)O-GlcNAc糖基化信號(hào)，而PKM2蛋白上檢測(cè)到16個(gè)O-Glc

11、NAc糖基化信號(hào)。為之后進(jìn)行O-GlcNAc糖基化修飾的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本課題通過Lipofectamin2000將HK2和PKM2的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，然后經(jīng)過有限稀釋法加藥篩選出HK2和PKM2基因穩(wěn)定高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株;首先運(yùn)用shRNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)干擾HK2和PKM2基因的干擾片段，然后分別將含干擾HK2和PKM2基因的shRNA慢病毒顆粒感染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，通過加

12、藥篩選出了HK2和PKM2基因沉默的細(xì)胞株。
　　綜上所述，現(xiàn)已初步研究了體內(nèi)和體外試驗(yàn)中紫杉醇在抗腫瘤活性中對(duì)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾的影響及其機(jī)制。本論文發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高，并初步探討了其機(jī)制;蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平的改變沒有影響紫杉醇的細(xì)胞增殖抑制活性;檢測(cè)出了PKM2和HK2的O-GlcNAc糖基化位點(diǎn)，而且還成功構(gòu)建了HK2和PKM2基因高表達(dá)和基因沉默的系列細(xì)胞株。