O-GlcNAc糖基化修飾在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機制研究.pdf

1、1984年,Torres和Hart發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸上存在O連接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)單糖修飾。O-GlcNAc修飾基團(tuán)添加和移除分別由糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNActransferase,OGT;EC2.4.1.94;GI:6006036)和糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA;EC3.2.1.52;GI:13646137)完成。到目前為

2、止,已發(fā)現(xiàn)超過1000種蛋白質(zhì)被O-GlcNAc糖基化修飾,O-GlcNAc修飾影響蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞定位、蛋白降解并參與各種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)。O-GlcNAc修飾在Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)性退行性疾病和心腦血管疾病中的作用都已給予了廣泛而深入的研究,本論文對O-GlcNAc修飾在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中作用及其機理的研究,填補了該領(lǐng)域研究空白。以人類最普遍的乳腺癌和肺癌為例,本論文系統(tǒng)研究了O-GlcNAc糖基化修飾對癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移的作用及其機

3、制。
　　 首先,對31例病人乳腺癌及其匹配的癌旁組織用O-GlcNAc抗體進(jìn)行免疫染色,結(jié)果顯示乳腺癌的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中O-GlcNAc修飾水平都顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織。同時,對31例病人肺癌及其匹配的癌旁組織進(jìn)行免疫染色,結(jié)果顯示肺癌的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中O-GlcNAc修飾水平都顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織。上述結(jié)果表明O-GlcNAc修飾水平與腫瘤發(fā)生有正相關(guān)性,暗示O-GlcNAc修飾可能在腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用

4、。
　　 其次,對O-GlcNAc修飾在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行研究。以人和小鼠的代表性乳腺癌和肺癌細(xì)胞株為研究對象,利用慢病毒載體通過RNAi技術(shù)構(gòu)建了O-GleNAc修飾降低的穩(wěn)定細(xì)胞株;用OGA特異性抑制劑PUGNAc處理得到O-GlcNAc修飾增加的細(xì)胞模型。在體外,采用上述細(xì)胞模型進(jìn)行了O-GlcNAc修飾對腫瘤細(xì)胞生物行為學(xué)的研究:O-GlcNAc修飾對乳腺癌和肺癌細(xì)胞的增殖無明顯影響但顯著增強了腫瘤細(xì)胞克

5、隆形成能力;O-GlcNAc修飾抑制腫瘤細(xì)胞之間黏附,使腫瘤細(xì)胞更容易分散;O-GlcNAc修飾顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在Transwell小室中的遷移能力。在體內(nèi),利用小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型研究了O-GlcNAc修飾對腫瘤發(fā)生與肺轉(zhuǎn)移能力的影響,結(jié)果顯示O-GlcNAc修飾對小鼠乳腺癌原位瘤的生長沒有影響,但顯著促進(jìn)了肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù),促進(jìn)了乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移能力。通過體外體內(nèi)實驗同時證明,O-GlcNAc修飾對腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有重要促進(jìn)作用。

6、　　 再次,為了闡明O-GlcNAc修飾促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制,我們對影響腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的經(jīng)典信號通路進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc修飾抑制了細(xì)胞黏附因子E-cadherin的表達(dá)。E-cadherin是胚胎發(fā)生與發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,尤其在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮重要作用。通過RNAi技術(shù),沉默腫瘤細(xì)胞中E-cadherin表達(dá),促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞體外遷移能力;在此基礎(chǔ)上,通過OGT和E-cadherin雙干擾技術(shù)和OGA

7、抑制劑處理兩種手段同時證明了E-cadherin介導(dǎo)了O-GlcNAc修飾對腫瘤細(xì)胞體外遷移能力的促進(jìn)作用;在體內(nèi),利用小鼠模型同樣證實了E-cadherin介導(dǎo)O-GlcNAc修飾對小鼠肺轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)作用。因此,體內(nèi)體外實驗同時證明E-cadherin表達(dá)抑制是O-GlcNAc修飾促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要機制。
　　 最后,我們又進(jìn)一步探究了O-GlcNAc修飾抑制E-cadherin表達(dá)的機理。定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)O-G

8、lcNA修飾c對E-cadherin的mRNA水平幾乎沒有影響;半衰期實驗證實O-GlcNAc修飾加速了E-cadherin蛋白的降解,因此,O-GlcNAc修飾降低E-cadherin表達(dá)是通過促進(jìn)E-cadherin降解實現(xiàn)的。我們對E-cadherin進(jìn)行了O-GlcNAc修飾檢測,結(jié)果表明E-cadherin沒有O-GlcNAc修飾,并且改變細(xì)胞中O-GlcNAc修飾水平對E-cadherin的絲氨酸和酪氨酸磷酸化都沒有影響。因

9、此,并不是O-GlcNAc修飾對E-cadherin的直接修飾促進(jìn)其降解。在免疫共沉淀實驗中發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc修飾抑制了E-cadherin和p120相互作用,并且前人研究已證明p120蛋白具有穩(wěn)定E-cadherin的作用,所以我們對p120蛋白進(jìn)行了O-GlcNAc修飾的檢測,并首次證明P120蛋白具有O-GlcNAc修飾,所以推測p120的O-GlcNAc修飾抑制了其與E-eadherin的結(jié)合,從而促進(jìn)E-cadherin的降