低氧誘導(dǎo)因子在大鼠角膜新生血管形成中的表達(dá).pdf

1、背景：角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)破壞角膜的透明性，影響視力，嚴(yán)重時(shí)甚至致盲。多種病理因素可以導(dǎo)致CNV的形成，但是CNV的形成機(jī)制目前還尚未明確。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)CNV的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)也日趨深入，低氧誘導(dǎo)因子在CNV發(fā)病機(jī)制中的作用也得到重視。研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子(HIF)是各種低氧誘導(dǎo)基因調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以上調(diào)多種靶基因的表達(dá)，但迄今為止，HIF參與新生血管形成的機(jī)制仍不

2、清楚，角膜中是否表達(dá)HIF及何種類型細(xì)胞表達(dá)HIF也不清楚。
　　 目的：研究正常和縫線后大鼠角膜低氧誘導(dǎo)因子1α和2α（HIF1α、HIF2α），隨新生血管形成的表達(dá)變化和表達(dá)的細(xì)胞類型及與炎癥細(xì)胞的關(guān)系，探討HIF在角膜新生血管形成中可能的作用，為揭示角膜新生血管形成的機(jī)制提供依據(jù)。
　　 方法：以縫線誘導(dǎo)方法建立大鼠角膜新生血管模型，將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和4個(gè)縫線實(shí)驗(yàn)組，每組15只。對(duì)照組不做任何處理，實(shí)驗(yàn)

3、組進(jìn)行角膜縫線誘導(dǎo)新生血管形成。在縫線后第1、3、5、7天，觀察大鼠CNV的生長(zhǎng)情況并記錄CNV的生長(zhǎng)面積，并取角膜組織分別進(jìn)行提取RNA、蛋白和固定及包埋切片，以實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timeRT-PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)、原位雜交(insituhybridization)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)HIF1α和HIF2α在大鼠角膜縫線后各

4、時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)和細(xì)胞的定位。并通過(guò)RT-PCR方法克隆大鼠HIF1α和HIF2α的cDNA，構(gòu)建大鼠HIF1α和HIF2α的表達(dá)載體，以檢驗(yàn)?zāi)鼙籋IF1α和HIF2α抗體檢測(cè)的大鼠角膜組織蛋白是否屬于HIF1α和HIF2α蛋白。
　　 結(jié)果：對(duì)照組的角膜透明無(wú)血管，實(shí)驗(yàn)組在角膜縫線后第1、3、5、7天，新生血管逐漸增多增長(zhǎng)，面積逐漸增大。正常大鼠角膜的蛋白和mRNA中均能檢測(cè)到HIF1α和HIF2α的表達(dá)，HIF1α和HIF2α的

5、mRNA均表達(dá)于角膜組織的各層細(xì)胞。大鼠角膜縫線后，HIF1α的蛋白表達(dá)隨角膜新生血管的增多而減少，但對(duì)VEGFa蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響，HIF1αmRNA的表達(dá)隨角膜新生血管的增多先增加后減少，不僅表達(dá)在角膜組織的各層細(xì)胞，也表達(dá)在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞，但不表達(dá)在浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞;HIF2α的mRNA也表達(dá)在角膜組織的各層細(xì)胞和新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞，也隨角膜新生血管的增多先增加后減少，但其蛋白的表達(dá)則沒(méi)有變化。大鼠HIF1α存在兩個(gè)亞型(iso

6、form)，它們的蛋白分子量分別為84和91kDa;HIF2α蛋白的分子量則為96kDa。
　　 結(jié)論：正常大鼠角膜均有HIF1α和HIF2α蛋白和mRNA的表達(dá)。正常角膜可能是處于低氧狀態(tài)。大鼠角膜HIF1α蛋白的表達(dá)不是隨著角膜新生血管的增多而增多，暗示HIF1α不是通過(guò)其表達(dá)的上調(diào)直接促進(jìn)促血管生成因子的轉(zhuǎn)錄而參與新生血管的形成，其功能需要進(jìn)一步的研究。HIF2α蛋白的表達(dá)不隨角膜新生血管的形成而改變，表明HIF2α可能不