缺氧誘導(dǎo)因子-1和血管內(nèi)皮生長因子在激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管中的表達(dá).pdf

1、研究背景脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)源自脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)，為突破Bruch膜長入視網(wǎng)膜下腔的異常血管。由于形成的CNV血管通透性高，從而可引起滲出、出血及變性以致視力下降。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CNV的生成是一進(jìn)展性過程，有多種因子參與，血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)就是其中重要的因子之一。VEGF是高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂

2、素，選擇性刺激內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcell，EC)增生、移行和管腔形成，并誘導(dǎo)EC抗凋亡蛋白的表達(dá)，亦可引起血管通透性增加。VEGF在CNV生成中的作用受到越來越多人們的重視。近來研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧組織中缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)是調(diào)節(jié)VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，它不僅可以增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活化，增加其mRNA的穩(wěn)定性，還可上調(diào)VEGF受體的表達(dá)，從而促進(jìn)血管新生。CNV

3、主要見于年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)。大量的軟性玻璃膜疣沉積以及Bruch膜和RPE之間層狀沉積物的形成均可影響氧和營養(yǎng)物質(zhì)從脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層向RPE和光感受器層的擴(kuò)散。局部組織低氧環(huán)境可打破促血管生成因子和抑制因子之間的平衡，使促血管生成因子過度表達(dá)，而誘導(dǎo)新生血管的形成。因此，對于HIF-1的研究將有助于揭示CNV的生成機(jī)制，為有效抑制CNV的生成提供思路。 目的

4、通過觀察HIF-1α和VEGF在532nm倍頻激光誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性CNV中的表達(dá)情況，探討CNV發(fā)生機(jī)制。 方法利用532nm倍頻激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型，分別于光凝后1、3、7、14、21、28、56和110d行眼底彩色照相、熒光素眼底血管造影(fundusfluoresceinangiography,FFA)、吲哚青綠血管造影(indocyaninegreenangiography,ICGA)、組織病理學(xué)和電鏡觀察，了解C

5、NV的生成過程及其形態(tài)特征。在光凝后1、3、7、14、21和28d進(jìn)行原位雜交法、免疫組織化學(xué)法和免疫熒光雙標(biāo)記法檢測，觀察HIF-1α、VEGFmRNA和其蛋白在CNV中的表達(dá)。 結(jié)果眼底彩色照相、FFA及ICGA觀察表明光凝后1d和3d光凝區(qū)無CNV生成，組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察表明，Bruch膜和色素上皮層(retinalpigmentepithelial，RPE)明顯破壞，其中可見中性粒細(xì)胞、色素性巨噬細(xì)胞和移行增生呈多

6、層生長的RPE細(xì)胞，Ⅷ因子標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞在損傷區(qū)有移行增生；光凝后7d，F(xiàn)FA和ICGA早期顯示光凝區(qū)呈強(qiáng)熒光，晚期有熒光素滲漏，表明CNV生成。Ⅷ因子著色的內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管，源于深層脈絡(luò)膜血管，呈梭形，其中可見色素性巨噬細(xì)胞、移行增生的RPE細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。光凝后14dCNV進(jìn)一步增生，中性粒細(xì)胞和色素性巨噬細(xì)胞減少，成纖維細(xì)胞和膠原纖維增多，RPE細(xì)胞移行增生包繞新生血管。新生血管增多，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞。之后CNV保持穩(wěn)定的

7、纖維血管組織。7～14d時，F(xiàn)FA顯示的早期CNV生成率、晚期熒光素滲漏率、熒光素滲漏面積、CNV厚度和平均血管密度(meanvasculardensity，MVD)均顯著增加(P＜0.05)，14d后變化不顯著(P＞0.05)。隨著時間延長，光斑的熒光素滲漏逐漸減弱，至110d時部分光斑熒光素滲漏消失；除CNV厚度外，其余各指標(biāo)值均顯著降低(P＜0.05)。原位雜交法觀察，正常大鼠視網(wǎng)膜有HIF-1α和VEGFmRNA的表達(dá)；光凝后3

8、d時HIF-1α和VEGFmRNA呈強(qiáng)陽性表達(dá)，持續(xù)至7d。前者于光凝后3d達(dá)高峰，而后者于光凝后7d達(dá)高峰，14d后兩者表達(dá)均迅速降低(P＜0.05)。兩者的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性(r=0.778，P＜0.05)。免疫組織化學(xué)法和免疫熒光雙標(biāo)記法觀察表明，正常大鼠視網(wǎng)膜幾乎無HIF-1α蛋白的表達(dá)，而神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、RPE層、視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜EC可見有VEGF蛋白的表達(dá)。光凝后1d光凝區(qū)HIF-1α表達(dá)明顯增加，而VEGF的表達(dá)無明

9、顯變化；3d時HIF-1α和VEGF蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，持續(xù)至7d。HIF-1α的表達(dá)在光凝后3d達(dá)高峰，VEGF在7d時達(dá)高峰，14d后兩者表達(dá)均迅速降低(P＜0.05)。兩者的表達(dá)具有顯著的相關(guān)性(r=0.588，P＜0.05)。結(jié)論532nm倍頻激光可成功地誘導(dǎo)BN大鼠CNV的生成。光凝后3d，光凝區(qū)有內(nèi)皮細(xì)胞增生。CNV于光凝后7d生成，14d之后趨于穩(wěn)定，可維持至110d。光凝后HIF-1α表達(dá)早于VEGF，二者均在CNV生成早