甘草細(xì)胞培養(yǎng)合成甘草黃酮及其調(diào)控研究.pdf

1、甘草被尊稱為“國(guó)老”，在中醫(yī)中常有“十方九草”之說(shuō)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、止咳化痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效。解決甘草資源短缺的最有效的方法之一是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的方式來(lái)生產(chǎn)有價(jià)值的活性物質(zhì)。本文旨在建立甘草細(xì)胞培養(yǎng)高產(chǎn)合成甘草黃酮的方法，主要圍繞甘草細(xì)胞系的建立、甘草黃酮快速檢測(cè)方法的建立以及提高甘草黃酮產(chǎn)量的方法等方面開展了較為系統(tǒng)的研究，取得了以下的成果：
　　 (1)篩選得到高產(chǎn)黃酮不產(chǎn)甘草酸的甘草細(xì)胞系，并對(duì)高產(chǎn)黃酮細(xì)胞

2、系進(jìn)行了特征分析。結(jié)果表明，用濃硫酸處理40min 后，甘草種子的萌發(fā)率最高。在甘草愈傷組織誘導(dǎo)形成時(shí)，采用MS+2,4-D (1.0 mg L-1)＋6-BA (1.0 mg L-1)＋NAA (1.0 mgL-1)培養(yǎng)基并以下胚軸為外植體的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到90[％]，最佳繼代培養(yǎng)基為MS+
　　 NAA (0.5 mg L-1)＋2,4-D (0.5 mg L-1)＋6-BA (0.5 mg L-1)。脹果甘草細(xì)胞合成甘草總

3、黃酮含量最高，其在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線呈“S”型，細(xì)胞在快速生長(zhǎng)末期第26天左右繼代比較合適，能夠保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 (2)分析了懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞中甘草黃酮的成分，并建立了快速檢測(cè)甘草黃酮的方法。薄層層析結(jié)果表明，甘草根中的主要黃酮成分與甘草細(xì)胞中的黃酮成分基本相同。通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用方法，確定細(xì)胞中含有的黃酮物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為593、559、270、309、487、589、309。此外，黃酮類化合物特有的顯色反應(yīng)表明

4、，甘草細(xì)胞中的黃酮類是不包含鄰二酚羥基的黃酮、黃酮醇、二氫黃酮類。
　　 (3)建立了穩(wěn)定的甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，確定了甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。其中，選擇MS基本培養(yǎng)基，接種量為4[％]-6[％]，在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”型，第21天干重、鮮重和黃酮總產(chǎn)量都達(dá)到了最高值，分別為16.4 g L-1、232.4g L-1和95.7 mg L-1。
　　 (4)研究了在逐級(jí)放大搖瓶中懸浮培

5、養(yǎng)甘草細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮合成的規(guī)律。隨著搖瓶體積的增加，細(xì)胞的最大生物量、黃酮產(chǎn)量以及最大比生長(zhǎng)速率都在不同程度的下降，營(yíng)養(yǎng)消耗也存在一定的差異。在逐級(jí)放大的搖瓶中，氮、磷濃度都隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，三種搖瓶中磷基本都被消耗完了。
　　 對(duì)于碳源，蔗糖在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化為能夠被植物細(xì)胞直接利用的還原糖，并且在培養(yǎng)的第22天幾乎被利用完了。因此在反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，必須要充分考慮溶解氧的問題，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件。

6、
　　 (5)研究了不同濃度的水楊酸、茉莉酸甲酯和真菌多糖對(duì)甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞合成黃酮的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，一定濃度的茉莉酸甲酯、水楊酸和真菌多糖能夠誘導(dǎo)提高甘草總黃酮的產(chǎn)量，而且導(dǎo)致細(xì)胞中H2O2 含量升高，苯丙氨酸裂解酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶活性的增強(qiáng)和丙二醛含量升高。這說(shuō)明一定濃度的茉莉酸甲酯、水楊酸和真菌多糖能夠引起細(xì)胞產(chǎn)生防御反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)甘草黃酮的積累。
　　 (6)研究了前體物質(zhì)苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙

7、酸鈉的添加對(duì)懸浮培養(yǎng)甘草細(xì)胞生長(zhǎng)和甘草黃酮合成的影響。結(jié)果表明，4種前體在合適的濃度下對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有抑制作用，而且均能促進(jìn)甘草黃酮的生物合成。苯丙氨酸的最佳添加濃度為20 mg L-1，酪氨酸、肉桂酸和乙酸鈉的最佳添加濃度都是5 mg L-1，此時(shí)，均可使培養(yǎng)體系的黃酮產(chǎn)量高達(dá)100 mg L-1 以上，其中酪氨酸的添加使得黃酮產(chǎn)量為對(duì)照的1.43 倍。苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸鈉3種前體的添加時(shí)間均以第10天為宜，酪氨酸添加時(shí)間以第5天

8、為最佳。前體物質(zhì)的混合添加對(duì)黃酮合成的影響高于單獨(dú)添加，這說(shuō)明不同的前體之間可能存在協(xié)同作用。
　　 (7)研究了干旱脅迫對(duì)甘草細(xì)胞的生長(zhǎng)及黃酮積累的影響，以考察甘草細(xì)胞的耐旱特征及其與甘草黃酮合成的關(guān)系。結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)母珊得{迫能夠促進(jìn)甘草黃酮的積累。干旱脅迫導(dǎo)致甘草細(xì)胞產(chǎn)生大量的H2O2，而且提高了過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶活性，提高了丙二醛的含量。這說(shuō)明適當(dāng)?shù)母珊得{迫能夠增強(qiáng)細(xì)胞防御體系的抗氧化性酶活，以增強(qiáng)細(xì)胞的抗旱性，同時(shí)