雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物中黃酮類物質(zhì)代謝調(diào)控及其生物活性成份分析.pdf

1、水母雪蓮(Saussurea medusa Maxim.)和新疆雪蓮(Saussurea involucrata Karel.et Kir.)是我國珍稀的藥用植物資源，具有清熱解毒、止痙鎮(zhèn)痛、斂傷、消腫及治療熱病、風(fēng)濕等多種功效。雪蓮的主要藥用成份為紫丁香甙(Syrmgin)、蘆丁(Rutin)、高車前素(Hispidulin)和Jaceosidin等苯基丙酸類(phenylpropanoid)和黃酮類(flavonoids)物質(zhì)。最新

2、的藥理研究表明，上述物質(zhì)還具有抗菌消炎、保肝降壓、延緩衰老和抑制癌細(xì)胞增殖等重要的研發(fā)價(jià)值。
　　 雪蓮生境惡劣，生長緩慢，人工引種困難，加上長期掠奪性采挖，已使雪蓮處于滅絕的邊緣。為了保存國家珍稀植物品種，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，滿足臨床上對雪蓮藥物的需求，本研究在雪蓮組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用誘導(dǎo)子添加技術(shù)和毛狀根培養(yǎng)技術(shù)對雪蓮中具有重要藥用價(jià)值的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，并對雪蓮MYB類轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行了初步探索，為保護(hù)珍稀植物資源、維護(hù)

3、生態(tài)環(huán)境、開發(fā)野生雪蓮替代產(chǎn)品、縮短雪蓮藥用成份的生產(chǎn)周期奠定了基礎(chǔ)。另外，分析了野生雪蓮和雪蓮培養(yǎng)物中主要生物活性成份的種類及含量，為今后雪蓮藥理藥效研究及品質(zhì)評價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了提高雪蓮黃酮的產(chǎn)量，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，在細(xì)胞培養(yǎng)水平上，通過添加茉莉酸甲酯(MJ)，對雪蓮黃酮類物質(zhì)的代謝進(jìn)行調(diào)控。研究了誘導(dǎo)子的添加時(shí)間、添加濃度對水母雪蓮紅色系懸浮細(xì)胞的生物量和總黃酮產(chǎn)量的影響。發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)的指數(shù)期(第9天)添加5

4、.0μmol/L的MJ，可以使總黃酮產(chǎn)量提高2.4倍(1134.5±63.86mg/L)，而雪蓮細(xì)胞干重(dw)僅比對照提高23.8％(20.4±0.27 g/L)。另外，細(xì)胞中苯丙氨酸裂解酶(PAL)的活性分析表明，MJ添加后PAL活性的增加與雪蓮總黃酮含量增長之間存在相關(guān)性。
　　 在器官培養(yǎng)水平上，對雪蓮毛狀根的誘導(dǎo)頻率及其培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，選擇發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染預(yù)培養(yǎng)2天的新疆雪蓮根段外植體，毛狀根的誘

5、導(dǎo)效率可達(dá)到83％。毛狀根的冠癭堿檢測、PCR和Southern分析表明，Ri質(zhì)粒中的T-DNA已整合到植物基因組中并穩(wěn)定表達(dá)。以新疆雪蓮毛狀根為外植體，能夠容易地獲得再生芽。在含有1.0 mg/L6-BA的MS固體培養(yǎng)基上，其再生頻率高達(dá)91±5.9％，是其正常根的2.4倍。而水母雪蓮在該培養(yǎng)條件下，僅有少量的畸形芽出現(xiàn)。進(jìn)而對毛狀根的培養(yǎng)條件進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明在無激素附加的MS液體培養(yǎng)基中，新疆雪蓮的HR1601根系在一個(gè)培養(yǎng)周

6、期內(nèi)(32天)，其生物量能夠達(dá)到接種量的16倍，而紫丁香甙含量(43.5±1.13 mg/g dw)能夠達(dá)到野生雪蓮的83倍。從而顯示了雪蓮毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)良特性。
　　 在基因水平上，對雪蓮黃酮類物質(zhì)代謝調(diào)控的研究已經(jīng)展開。玉米P基因編碼的Myb類轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)黃酮類物質(zhì)代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。根據(jù)P基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，從雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得了SmP基因。核酸序列分析表明，Smp基因與煙草中涉及苯丙素類物質(zhì)代謝途徑的

7、LBM1、LBM3和MybAS1基因具有較高的一致性，分別為66％、60％和61％。因此為了研究雪蓮Smp基因的功能，構(gòu)建了正義表達(dá)載體，并與先前構(gòu)建好的反義表達(dá)載體分別導(dǎo)入煙草，分析了轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)特征及黃酮類物質(zhì)的含量變化。其中，約有30％轉(zhuǎn)反義Smp基因的株系表現(xiàn)葉片皺縮、葉脈紊亂、主側(cè)脈角度縮小、葉片、花瓣失去對稱性以及花粉敗育等性狀。
　　 另外，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了雪蓮提取工藝的條件，并對雪蓮細(xì)胞提取物進(jìn)行了分離

8、純化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明，溫度對雪蓮黃酮提取效率的影響極為顯著，而分批多次提取比一次性浸提，能夠收到較好的提取效果。考慮到工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際問題，推薦在60℃水浴條件下，采用50％乙醇對雪蓮樣品連續(xù)浸提2次的方案。對雪蓮提取物的純化研究表明，雪蓮成份復(fù)雜，僅依靠單一的分離手段，往往難以奏效。另外，野生雪蓮及雪蓮培養(yǎng)物中生物活性成份的比色法、HPLC(High Performance Liquid Chromatography)、LC-E

9、SI-MS(Liquid ChromotagraphyElectrospray Ionization Mass Spectrometry)分析表明，傳統(tǒng)的NaNO2-AlCl3法測定雪蓮總黃酮的含量，結(jié)果偏高，不利于雪蓮黃酮的實(shí)驗(yàn)室研究分析與今后工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量監(jiān)控。而AlCl3法的顯色反應(yīng)較為特異，今后有望取代NaNO2-AlCl3法，作為雪蓮類藥材品質(zhì)評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。而HPLC-DAD結(jié)合LC-ESI-MS可以對雪蓮中的主要生物活性成份