日本血吸蟲重組膜外蛋白rSj29免疫診斷的初步應(yīng)用及代謝抗原單克隆抗體的制備.pdf

1、血吸蟲病在我國分布廣泛，危害嚴(yán)重，至今仍是重要的公共衛(wèi)生問題?？焖?，準(zhǔn)確的早期診斷在血吸蟲病的防治中起著重要作用。血吸蟲病的診斷主要有病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查，病原學(xué)診斷是確診病人的主要方法，但費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，對慢性感染和低度感染者容易漏檢。因此尋找高度敏感、特異以及建立經(jīng)濟(jì)、可靠、能夠考核療效的免疫診斷方法依然是當(dāng)前血吸蟲病基礎(chǔ)研究的重要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)室在前期已克隆表達(dá)了重組日本血吸蟲四跨膜超家族蛋白（SjTsp2-A）和29 000膜外蛋白

2、（Sj29），rSj29 ELISA在實(shí)驗(yàn)室用于血吸蟲病人血清循環(huán)抗體的檢測，獲得較好的敏感性和特異性。我們重新純化了rSj29蛋白和rSjTsp2蛋白，用30份混合陽性血清及30份混合陰性血清進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了最佳抗原包被濃度、二抗?jié)舛?。隨后，從血吸蟲病低度流行區(qū)蕪湖南陵縣采集394份糞便標(biāo)本，男女隨機(jī)，年齡5-80歲，改良加藤法三送九檢，或集卵孵化法檢測，同時(shí)采集其血清，進(jìn)行間接血凝試驗(yàn)（糞便檢查

3、和間接血凝試驗(yàn)，由安徽省血吸蟲病防治研究所完成），用rSj29間接ELISA法和AWA間接ELISA法檢測血清相應(yīng)抗體，每個(gè)樣本均作復(fù)孔，采用單盲法檢測，并與間接血凝試驗(yàn)和糞檢方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示陽性率：糞檢，IHA，rSj29-ELISA，AWA-ELISA陽性率分別為4.82％（19/394），62.18％（245/394），68.27％（269/394)和89.85％（354/394)。其中血清學(xué)檢測的陽性率均顯著高于糞檢（x

4、2=1259.7，P<0.01），IHA與AWA-ELISA符合率為63.20％，均為陽性者為227例，均為陰性者為22例；IHA與rSj29-ELISA符合率為80.71％，均為陽性者為219例，均為陰性者為99例。IHA與rSj29-ELISA的符合率較高。IHA與糞檢結(jié)果比較，其敏感度，特異度，與糞檢符合率分別為100％，39.73％，42.64％；rSj29-ELISA分別為94.74％，33.33％，36.04％；AWA-EL

5、ISA分別為100％，10.67％，14.97％。rSj29-ELISA與IHA敏感性（P=0.5）和特異性（x2=3.56，P>0.05）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rSj29-ELISA與AWA-ELISA相比敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.5），特異性rSj29-ELISA高于AWA-ELISA（x2=55.98，P<0.05）。表明rSj29間接ELISA法診斷日本血吸蟲病與IHA相比具有相似的敏感性和特異性，且制備方法簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化，

6、可用于血吸蟲病的免疫診斷初篩。
　　 但ELISA和IHA法的特異性較低，抗體檢測難以區(qū)分過去感染(包括經(jīng)化療治愈者)與現(xiàn)癥感染，陽性率并非真實(shí)地反映現(xiàn)癥病人。而循環(huán)抗原檢測能更確切地反映療效，更可靠地判斷宿主體內(nèi)有無活蟲存在，提供準(zhǔn)確的治療依據(jù)及流行病學(xué)資料。隨著單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)和完善，現(xiàn)多用單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行循環(huán)抗原檢測。
　　 為此我們制備了抗日本血吸蟲代謝抗原（Sj-Mag）的單克隆抗體。將尾蚴常規(guī)感染家兔，

7、42天時(shí)處死家兔，門靜脈灌注獲得日本血吸蟲成蟲，通過體外培養(yǎng)制備了日本血吸蟲成蟲代謝抗原，鑒定該蛋白具有免疫反應(yīng)性，能夠識別日本血吸蟲病人血清。蛋白免疫小鼠6周后，測定小鼠免疫效價(jià)達(dá)1：32 000以上。小鼠尾靜脈注射純蛋白以加強(qiáng)免疫，三天后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交融合，HAT選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，間接ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選陽性克隆，經(jīng)三次亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得了兩株能夠穩(wěn)定分泌抗Sj-Mag的單克隆