蘋果寡糖的制備、結(jié)構(gòu)鑒定與抗腫瘤活性研究.pdf

1、多糖具有廣泛的生物活性,其腫瘤防治作用引起了大家的關(guān)注。目前,全球至少有超過(guò)30種多糖在臨床進(jìn)行抗腫瘤、抗艾滋病及治療糖尿病試驗(yàn)。在日本已有香菇多糖,在我國(guó)則有牛膝多糖、云芝多糖、靈芝多糖和豬苓多糖被批準(zhǔn)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)室研究表明,低分子蘋果多糖對(duì)防治結(jié)/直腸癌,具有潛在的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。然而,天然多糖類藥物研發(fā)存在以下突出問(wèn)題:(1)聚糖多以高分子形式存在,分子量范圍跨度大,均一性差,結(jié)構(gòu)不清楚,難于質(zhì)量控制。(2)藥物活性重復(fù)性差,難

2、于在分子水平闡明其作用機(jī)制。(3)大分子多糖在體內(nèi)很難進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),體內(nèi)過(guò)程不明。(4)提取分離技術(shù)與質(zhì)量控制滯后,現(xiàn)有的提取工藝難以獲得結(jié)構(gòu)均一的多糖。低分子化、均一化是實(shí)現(xiàn)天然糖類藥物質(zhì)量可控的重要策略。
　　目的:
　　建立蘋果寡糖的制備、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定的新方法,觀察蘋果寡糖的抗腫瘤作用及其機(jī)制,為開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蘋果寡糖類藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用水提醇沉的方法,從蘋果渣中分離得到

3、蘋果粗多糖,去除蛋白和色素,再經(jīng)透析分段、DEAE-52和Sepharose CL-4B凝膠柱層析分離得到兩個(gè)組分AP-1和AP-2B。對(duì)蘋果多糖和純化后的兩種多糖進(jìn)行糖含量、分子量和UV、IR、旋光度以及單糖組成表征。
　　2.采用堿解和酶解相結(jié)合的方法,制備蘋果寡糖,采用陰離子交換樹(shù)脂對(duì)寡糖混合物進(jìn)行分離,得到OS-1、OS-2、OS-3、OS-4和OS-5。采用HPLC柱前衍生化法、MS和NMR對(duì)OS-5結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表征。<

4、br>　　3.MTT法檢測(cè)OS-1、OS-2、OS-3、OS-4、OS-5和AP-1對(duì)6株腫瘤細(xì)胞及人正常上皮細(xì)胞HIEC活性的影響,篩選出抗腫瘤效果最好的寡糖進(jìn)行體外抗腫瘤機(jī)制研究。采用OS-5處理HT29細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HT29細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化情況,透射電鏡法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;蛋白印跡法檢測(cè)凋亡和周期相關(guān)蛋白的變化情況,同時(shí)采用real time PCR法檢測(cè)相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá),探討OS-5抗腫瘤作用機(jī)制。<

5、br>　　4.復(fù)制致炎劑/致癌劑誘導(dǎo)的ICR小鼠結(jié)腸癌模型和裸鼠HT29細(xì)胞移植瘤模型,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療學(xué)觀察。通過(guò)病理組織學(xué)方法,觀察結(jié)腸癌發(fā)生情況;通過(guò)ELISA和Western Blot檢測(cè)方法,觀察結(jié)腸癌小鼠血清TNF-α和Galectin-3含量變化和凋亡相關(guān)蛋白的變化。采用腫瘤體積和生存時(shí)間等指標(biāo),觀察OS-5對(duì)移植瘤小鼠腫瘤的抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)HPSEC分析可知,蘋果多糖是包含有三個(gè)不同分子量組分的

6、混合多糖,組分1和組分2為均一性多糖,分子量分別為10 kD和1900 kD。單糖組成分析結(jié)果顯示,蘋果多糖的單糖組成為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,摩爾比為1.00:17.67:8.50:4.01:2.03。組分1單糖組成為鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖,摩爾比為1.20:10.00:5.25;組分2單糖組成為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖,摩爾比為1.00:20.30:8.50:8.03。
　　2.HPSEC分

7、析結(jié)果表明,OS-5純度為99.21％,OS-5是由GalA組合而成,分子量為898,其結(jié)構(gòu)是由(1→4)-β和(1→6)-α-D-GalA線性連接形成的半乳糖醛酸寡聚糖,具體結(jié)構(gòu)為α-D-GalAp-(1→6)-α-D-GalAp-(1→6)-α-D-GalAp-(1→6)-β-D-GalAp-(1→4)-α-D-GalAp。
　　3.HIEC細(xì)胞經(jīng)9μg/mL OS-5處理36 h,其增殖率為37.3±1.8%。OS-5對(duì)A5

8、49、H1299、SMMC7721、HCT116和SW480細(xì)胞的活性抑制作用較小。給藥36 h,9μg/mL OS-5對(duì) H1299、SW480細(xì)胞活性抑制率分別為24.99±0.6%、23.4±1.4%,對(duì) A549細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的抑制率均低于10%。不同濃度OS-5作用于SMMC7721細(xì)胞24 h后,細(xì)胞抑制率均為25%,不呈現(xiàn)濃度依賴性。OS-5對(duì)HT29細(xì)胞活性抑制作用比較突出,且呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。給予HT29細(xì)

9、胞9μg/mL OS-5處理36 h后,抑制率為52.6±1.8%。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),10μmol/L OS-5處理后的HT29細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,10μmol/L OS-5處理后的HT29細(xì)胞凋亡率為45.9%(P<0.01),S期細(xì)胞占60.86±3.44%,與正常對(duì)照組細(xì)胞(未用OS-5處理,S期細(xì)胞占24.64±1.29%)具有顯著性差異(P<0.01),提示OS-5可誘導(dǎo)HT29細(xì)胞發(fā)生凋亡和S期阻滯。經(jīng)OS

10、-5處理后的HT29細(xì)胞,Bax蛋白表達(dá)量明顯升高,同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)顯著降低。OS-5能夠顯著降低HT29細(xì)胞中Cdk2和cyclin B1蛋白的表達(dá),同時(shí)增加cyclin A1蛋白表達(dá)量。
　　4.DMH/DSS誘發(fā)的結(jié)腸癌小鼠給予 OS-5后免疫器官指數(shù)和結(jié)腸長(zhǎng)度有所改善,胸腺指數(shù)比正常組和模型組顯著增高(P<0.05);HE染色結(jié)果顯示,OS-5可抑制結(jié)腸組織癌細(xì)胞的浸潤(rùn)生長(zhǎng)現(xiàn)象;OS-5治療組動(dòng)

11、物血清中 TNF-α水平顯著升高(P<0.01),血清中Galectin-3水平比模型組降低,但無(wú)顯著性差異;Western Blot顯示OS-5治療組結(jié)腸黏膜中Bax表達(dá)量升高,Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)降低,模型組黏膜中Bax表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明,OS-5對(duì)HT29細(xì)胞移植瘤具有明顯的抑制作用。第35 d時(shí),5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg OS-5給藥組腫瘤體積分別為:529.84

12、±44.01 mm3、443.81±38.94 mm3和358.96±28.68 mm3,與模型組腫瘤體積998.61±30.79 mm3相比,各給藥組腫瘤體積明顯減小(P<0.05)。模型組裸鼠中位生存時(shí)間為38.5 d,10 mg/kg和20 mg/kg OS-5給藥組裸鼠中位生存時(shí)間分別為39 d和47 d。
　　結(jié)論:
　　1.創(chuàng)立了可控性降解獲得蘋果寡糖的方法,得到了OS-1、OS-2、OS-3、OS-4和OS-5

13、五個(gè)組分。
　　2.經(jīng)分析鑒定,OS-5的結(jié)構(gòu)為α-D-GalAp-(1→6)-α-D-GalAp-(1→6)-α-D-GalAp-(1→6)-β-D-alAp-(1→4)-α-D-GalAp,未見(jiàn)相同的結(jié)構(gòu)報(bào)道。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OS-5對(duì)HT29細(xì)胞的活性有明顯抑制作用,其作用可能與上調(diào)Bax同時(shí)降低Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以及通過(guò)降低Cdk2和cyclin B1蛋白的表達(dá)同時(shí)增加cyclin A