間歇性低壓缺氧預(yù)處理抗大鼠全腦缺血-再灌注損傷及其機(jī)制初探.pdf

1、目的:1986年,Murry等人發(fā)現(xiàn),給心臟一次或多次短暫缺血后,可誘導(dǎo)心臟抵抗較嚴(yán)重缺血引起的損傷,稱之為缺血預(yù)處理,從此拉開了預(yù)處理研究的序幕。1990年,Kitagawa等的研究發(fā)現(xiàn),短暫腦缺血可增強(qiáng)海馬神經(jīng)元對(duì)以后嚴(yán)重缺血的耐受能力,提示對(duì)缺血極為敏感的海馬神經(jīng)元也具有這一內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。此后,有研究者證實(shí),低氧預(yù)處理(HypoxicPreconditioning,HP)對(duì)成年大鼠也具有腦保護(hù)作用,能夠使腦組織抵抗較嚴(yán)重缺血所致

2、的損傷,之后,又有遠(yuǎn)端器官缺血預(yù)處理等研究報(bào)道,這些研究使得預(yù)處理的方式不斷豐富,也為人們探索預(yù)處理抗組織缺血的機(jī)制開拓了思路。
　　 有關(guān)低氧預(yù)處理抗腦缺血以及腦缺血/再灌注(Ischemia Reperfusioninjury,I/R)損傷作用的研究已有一些報(bào)道,但低氧預(yù)處理的方法各異,目前尚缺乏公認(rèn)理想的預(yù)處理模型,有關(guān)低壓缺氧預(yù)處理的方式和作用的報(bào)道較少,更缺乏有關(guān)其作用機(jī)制的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)處理的一般

3、知識(shí),結(jié)合低氧預(yù)處理方面的有限資料,改良呂國(guó)蔚急性重復(fù)缺氖預(yù)處理動(dòng)物模型,建立間歇性低壓缺氧預(yù)處理(Intermittent Hypobaric Hypoxia Preconditioning,IHHP)動(dòng)物模型。采用四血管阻斷法致大鼠全腦缺血,觀察間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血8min后再灌注海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的影響,并初步探討其保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 1間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)改

4、變和海馬神經(jīng)元凋亡的影響
　　 方法:72只健康雄性Wistar大鼠,體重280～300g,隨機(jī)分為6組。每組12只動(dòng)物。分別為:①假手術(shù)組(Sham),只凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉。②間歇性低壓缺氧預(yù)處理組(IHHP),于凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈前6d開始,暴露于低壓(大氣壓為70.66-70.93kp)缺氧環(huán)境,每日一次,共6次,第7天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉。③缺血/再灌注組(I/R),

5、凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉8min,而后恢復(fù)血流再灌注。④間歇性低壓缺氧預(yù)處理2次+全腦缺血/再灌注組(IHH2+I/R),低壓缺氧預(yù)處理2天,每天一次,第3天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉8min,而后恢復(fù)血流再灌注。⑤間歇性低壓缺氧預(yù)處理4次+全腦缺血/再灌注組(IHHP4+I/R),低壓缺氧預(yù)處理4天,每天一次,第5天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉8min,而后恢復(fù)血流再灌注。⑥

6、間歇性低壓缺氧預(yù)處理6次+全腦缺血/再灌注組(IHHP6+I/R),低壓缺氧預(yù)處理6天,每天一次,第7天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉8min,而后恢復(fù)血流再灌注。12只動(dòng)物中,6只于再灌注后7天處死取海馬,用于硫堇染色觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)和存活神經(jīng)元數(shù)目;另外6只于再灌注后3天處死取海馬,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡率。
　　 組織學(xué)分級(jí)方法:參照Kato分級(jí)方法,在光學(xué)顯微鏡下對(duì)海馬CA1區(qū)組織學(xué)

7、改變進(jìn)行分級(jí)(Histological grade,HG)。0級(jí),無神經(jīng)元死亡;1級(jí),有散在的神經(jīng)元死亡;2級(jí),成片神經(jīng)元死亡;3級(jí),幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側(cè)海馬平均等級(jí)作為統(tǒng)計(jì)值。
　　 計(jì)數(shù)存活神經(jīng)元密度值:于高倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目,每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段,取平均值作為每一例的存活神經(jīng)元密度值(Neuronaldensity,ND)。
　　

8、 結(jié)果:
　　 1.1間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)及存活神經(jīng)元密度的影響
　　 Sham組錐體細(xì)胞排列整齊,幾乎無錐體細(xì)胞缺失現(xiàn)象,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞核及核仁完整清晰,組織學(xué)分級(jí)為0級(jí)～1級(jí)。存活神經(jīng)元密度值較高,為149.27±13.58(cells/mm,下同)。IHHP組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與Sham組比較變化不明顯,組織學(xué)分級(jí)無明顯改變(P＞0.05),神經(jīng)元密度值為13

9、5.57±14.60,與Sham組相比無顯著性差異(P＞0.05),但出現(xiàn)個(gè)別錐體細(xì)胞水腫及細(xì)胞間隙增寬的現(xiàn)象。I/R組大鼠海馬CA1區(qū)組織明顯損傷,核膜完整、核仁清楚的錐體細(xì)胞稀疏,排列紊亂,錐體細(xì)胞明顯缺失,存留細(xì)胞中部分細(xì)胞胞體形態(tài)不規(guī)則,呈多角型或梭型,胞膜皺縮,胞核固縮濃染,HG為2～3級(jí),ND為20.53±5.16,與Sham組相比,HG明顯升高,ND明顯減少(P＜0.01)。IHHP+I/R各組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列情況

10、和細(xì)胞形態(tài)均較I/R.組明顯改善,組織學(xué)分級(jí)降低(P＜0.01),其中IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組較IHHP2+I/R組組織學(xué)分級(jí)改善更加明顯(P＜0.01),與I/R組相比,IHHP2+I/R、IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組存活神經(jīng)元密度值均明顯增加(P＜0.01),分別為44.92±7.61、75.12±7.66和87.47±11.07,其中IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組較IHHP2+I/R神經(jīng)元密度

11、值增加更明顯(P＜0.01),但I(xiàn)HHP4+I/R和IHHP6+I/R組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 1.2間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注后海馬神經(jīng)元凋亡率的影響
　　 Sham組與IHHP組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率均較低,分別為2.68±0.49％和3.04±0.72％,IHHP組雖較Sham組有所升高,但二者相比無顯著性差異(P＞0.05)。與Sham組比較,I/R組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著增高(P＜

12、0.01),為14.78±2.74％。IHHP+I/R各組海馬神經(jīng)元凋亡率均較I/R組顯著降低(P＜0.01),IHHP2+I/R.、IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組分別為11.77±1.86％、7.09±1.6％和9.49±1.2％,其中IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組與IHHP2+I/R組比較,海馬神經(jīng)元凋亡率進(jìn)一步降低(P＜0.01),IHHP6+I/R組與IHHP4+I/R組比較,海馬神經(jīng)元凋亡率沒有進(jìn)一步降低反

13、而有所升高,提示預(yù)處理次數(shù)過多有可能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。
　　 2間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)Ngb和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響
　　 方法:24只健康雄性Wistar大鼠,體重280～300g,隨機(jī)分為4組。①假手術(shù)組(Sham),只凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉。②間歇性低壓缺氧預(yù)處理組(IHHP),于凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈前4d開始,暴露于低壓(大氣壓為70.66-70.93kp)缺

14、氧環(huán)境,每日一次,共4次,第5天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉。⑨缺血/再灌注組(I/R),凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露并夾閉頸總動(dòng)脈8min后恢復(fù)血液再灌流。④間歇性低壓缺氧預(yù)處理+全腦缺血/再灌注組(IHHP+I/R),低壓缺氧4天,每天一次,第5天凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48h后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉8min,而后恢復(fù)再灌注。各組動(dòng)物均于再灌注后24h取材,采用免疫組織化學(xué)方法觀察海馬CA1區(qū)腦紅蛋白(neuroglob

15、in,Ngb)及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia2,Bcl-2)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 ①單純間歇性低壓缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元無明顯影響,但可減輕大鼠全腦缺血/再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度,抑制神經(jīng)元凋亡,對(duì)全腦缺血/再灌注后大鼠海馬組織具有明顯的保護(hù)作用。
　　 ②適當(dāng)?shù)念A(yù)處理次數(shù)是誘導(dǎo)有效腦保護(hù)作用的必要條件。
　　 ③間歇性低壓缺氧預(yù)