MicroRNA介導(dǎo)的NBS1基因沉默與端粒酶和相關(guān)信號通路關(guān)系的研究.pdf

1、目的： NBS1是MRN復(fù)合物(MRE11/RAD50/NBS1復(fù)合物)中的重要基因，是DNA雙鏈斷裂修復(fù)中最重要的一個參與者。近年來一些研究表明MRN復(fù)合物對端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞的生存維系起著重要的作用，NBS1功能受損會使MRN復(fù)合物解離，阻止其功能的發(fā)揮，破壞端粒酶陰性細(xì)胞同源重組介導(dǎo)的端粒長度維持機制(alternative lengthening of telomeres,ALT)，導(dǎo)致其增殖受抑，它的過表達(dá)可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

2、和腫瘤發(fā)生，并與部分腫瘤預(yù)后有密切關(guān)系。關(guān)于NBS1與端粒酶機制的研究很少。最近有人研究顯示MRN的減少能導(dǎo)致端粒酶陽性細(xì)胞中端粒G-overhangs長度的瞬時縮短。他們在端粒酶陰性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Overhangs的長度沒有減少，但是在給與外源性端粒酶表達(dá)后則發(fā)生，因此猜測MRN復(fù)合物可能涉及到了端粒酶的復(fù)原或激活。對頭頸部惡性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)NBS1的表達(dá)水平與Akt的磷酸化水平相關(guān)，通過siRNA導(dǎo)致的內(nèi)源性Akt表達(dá)的抑制可減少過表達(dá)

3、NBS1的Ratla細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性。還有研究者則認(rèn)為NBS1是PI3K途徑的配體或激活子。對于NBS1與ERK1/2信號通路的關(guān)系目前則尚無人研究。 本研究利用RNA干擾領(lǐng)域一種新的研究手段和實驗工具—microRNA干擾基因表達(dá)的方式，研究MRN復(fù)合物的重要成分——NBS1基因沉默與端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞端粒酶活性之間的關(guān)系，并對PI3K/Akt及ERK1/2信號通路與NBS1基因沉默之間的關(guān)系進(jìn)行探討。 方法：

4、1、靶向NBS1基因的microRNA序列的設(shè)計合成與構(gòu)建 選擇NBS1基因mRNA序列中21nt片段為合適的microRNA靶序列，設(shè)計四個針對NBS1基因不同區(qū)域的64nt的pre-microRNA寡核苷酸序列，合成并構(gòu)建入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌。重組體分別命名為NBS1mi-1，NBS1mi-2，NBS1mi-3，NBS1mi-4。 2、重組體的鑒定

5、 對重組體首先在LB平板上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。挑取LB平板上的陽性克隆菌落，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，瓊脂糖電泳對重組體進(jìn)行初步鑒定。陽性克隆菌株LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取菌液質(zhì)粒并純化，送公司測序。 3、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 選擇70％以上匯合的Hela細(xì)胞，接種在培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染時細(xì)胞生長密度達(dá)到80％以上。實驗分組為空載體對照，陰性對照(正常細(xì)胞組)，NBS1mi-1，NBS1mi-2，NBS1mi-3，NBS1mi-4。每組設(shè)三

6、個平行孔。 4、轉(zhuǎn)染效率檢測 收集轉(zhuǎn)染12h后的細(xì)胞，進(jìn)行報告基因GFP的Real-TimePCR實驗確定轉(zhuǎn)染效率。 5、檢測NBS1基因mRNA表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染12h后的細(xì)胞，進(jìn)行NBS1基因的Real-TimePCR實驗確定其mRNA表達(dá)水平。 6、Westernblot檢測NBS1基因蛋白表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，Westernblot檢測NBS1mi-1，NBS1mi-2

7、，NBS1mi-3，NBS1mi-4重組體轉(zhuǎn)染組的NBS1基因蛋白表達(dá)水平，結(jié)合它們NBS1基因mRNA表達(dá)結(jié)果，選擇一個對NBS1基因的表達(dá)干擾效果最佳的microRNA真核表達(dá)重組載體進(jìn)行下一步實驗。 7、TRAP-PCR-EB法檢測細(xì)胞端粒酶活性 檢測microRNA介導(dǎo)的NBS1基因沉默對Hela細(xì)胞端粒酶活性的影響。 8、MTT法繪制細(xì)胞生長曲線 檢測microRNA介導(dǎo)的NBS1基因沉默對He

8、la細(xì)胞增殖的影響。 9、Westernblot檢測Akt，ERK1/2及其磷酸化蛋白表達(dá)水平 檢測microRNA介導(dǎo)的NBS1基因沉默與PI3K/Akt及ERK1/2信號通路的關(guān)系。 10、統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果以(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行T檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、設(shè)計出了四個靶向NBS1mRAN序列的microRNA序列 經(jīng)N

9、CBIBlast已排除其非特異同源性，并能與pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR真核表達(dá)載體的粘性末端互補配對。 2、重組體鑒定結(jié)果 菌落PCR、瓊脂糖電泳顯示擴增出的片段大小為250bp左右，符合預(yù)期結(jié)果。初步證明pre-miRNA片段已正確定向插入到載體中。測序分析證明重組體中含有目的片段，且插入片段的堿基序列完整，沒有堿基的突變以及丟失。 3、轉(zhuǎn)染效率 Real-TimePCR分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染

10、12h后陰性對照組、空載體對照組、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4的轉(zhuǎn)染效率分別為(57.26±1.04)％、(55.41±3.68)％、(45.51±2.62)％、(47.55±1.35)％、(50.23±3.27)％、(43.56±2.56)％，經(jīng)獨立樣本T檢驗分析，空載體對照組、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四個NBS1mi重組體組和陰性對照組相比轉(zhuǎn)染效

11、率的差異不顯著(P＞0.05)，它們彼此之間也沒有顯著差異(P＞0.05)，這提示各組之間GFPmRNA的擴增循環(huán)數(shù)及起始模板數(shù)沒有顯著的不同，即轉(zhuǎn)染效率沒有顯著的區(qū)別。 4、NBS1基因mRNA表達(dá)水平的變化 轉(zhuǎn)染12h后陰性對照組、空載體對照組、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4重組體組的NBS1基因mRNA表達(dá)量分別為0.86±0.16、0.78±0.16、0.24±0.17、0

12、.12±0.12、0.41±0.97、0.48±0.93。NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四個重組體組的NBS1mRNA表達(dá)水平和陰性對照組、空載體對照組之間相比較差異有顯著性(P＜0.05)。而空載體對照組和陰性對照組的NBS1mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P＞0.05)。NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四個重組體組中NBS1mi-2重組體組的NBS1mRNA表

13、達(dá)水平最低。 5、NBS1基因蛋白表達(dá)水平的變化 和陰性對照組相比，NBS1基因蛋白表達(dá)水平在NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四個重組體中都有所降低，其中NBS1mi-2轉(zhuǎn)染組的NBS1基因蛋白表達(dá)水平相對最低。而空載體對照組和陰性對照組相比則無明顯變化。結(jié)合NBS1mRNA表達(dá)的結(jié)果，可以確定在四個重組體中，NBS1mi-2重組體對NBS1基因的沉默效果最好。 6、Hela

14、細(xì)胞端粒酶活性的改變 根據(jù)NBS1基因的mRNA及蛋白表達(dá)檢測結(jié)果，選擇干擾效果最好的NBS1mi-2重組體轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測細(xì)胞端粒酶活性變化。和陰性對照組相比，NBS1mi-2的24h、48h、72h轉(zhuǎn)染組的Hela細(xì)胞端粒酶活性降低明顯(P＜0.05)。且隨著NBS1mi-2轉(zhuǎn)染時間的延長，Hela細(xì)胞端粒酶活性也逐漸下降，NBS1mi-2轉(zhuǎn)染72h后端粒酶活性的下降程度尤其顯著(P＜0.01)。而空載體對照組與陰性對照組相比無

15、明顯變化。 7、細(xì)胞生長狀態(tài)的改變 NBS1mi-2轉(zhuǎn)染組和陰性對照組、空載體對照組相比Hela細(xì)胞的生長曲線明顯趨緩，NBS1mi-2轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞的增殖速度變慢，細(xì)胞的增殖受到抑制。 8、磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平的變化 和陰性對照組相比，NBS1mi-2轉(zhuǎn)染組磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，而空載體對照組和陰性對照組相比則無明顯變化(P＞0.05)。Akt蛋白表達(dá)水平彼此之間無明

16、顯差異。 9、磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)水平的變化 和陰性對照組相比，NBS1mi-2轉(zhuǎn)染組磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)。而空載體對照組和陰性對照組相比則變化不顯著(P＞0.05)?？侲RK1/2蛋白表達(dá)水平彼此之間無明顯差異。 結(jié)論： 1、人工設(shè)計的靶向目的mRNA的pre-microRNA片段正確完整地插入到了pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR真核表達(dá)載體

17、之中，靶向NBS1基因的microRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建成功。 2、各實驗組之間的轉(zhuǎn)染效率并不相同，但彼此之間并沒有顯著性差異，這就消除了因各組轉(zhuǎn)染效率不同可能對其他各檢測指標(biāo)造成的誤差。因此，靶向NBS1基因的microRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功。這為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)。 3、NBS1基因沉默能導(dǎo)致端粒酶陽性細(xì)胞Hela細(xì)胞中的端粒酶活性的抑制。 4、NBS1基因沉默能導(dǎo)致端粒酶陽性細(xì)胞Hela細(xì)胞的增殖受