胰島素樣生長因子-1基因轉(zhuǎn)染對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨容易發(fā)生損傷和退變，再生能力差，對損傷軟骨的實驗治療主要集中在細(xì)胞的治療上，包括應(yīng)用成熟軟骨細(xì)胞及其他軟骨祖細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為成熟軟骨細(xì)胞的替代品越來越受到重視。MSCs可以很容易從骨髓中獲得，增殖傳代能力強，細(xì)胞均一性好，具多向分化潛能，能分化為各種類型組織，包括軟骨和骨。但轉(zhuǎn)移的MSCs在軟骨缺損部位還沒有產(chǎn)生令人滿意的關(guān)節(jié)軟骨。一個可能的問題是局部沒有足夠能刺激移植細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。體外研究報告顯示，

2、特異的蛋白因子能夠促進成人MSCs向軟骨細(xì)胞分化，提高體內(nèi)軟骨修復(fù)能力。相關(guān)的研究表明，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，F(xiàn)GF，BMP-2，BMP-6，IGF-1等生長因子具有成軟骨能力,因此可以在局部加入這些因子促進MSCs細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。但外源性細(xì)胞因子易于流失、作用時間短、價格昂貴。如果將這些細(xì)胞因子基因?qū)隡SCs中，通過自分泌相應(yīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，以此基因修飾的MSCs作為種子細(xì)胞來構(gòu)建組織工程

3、軟骨，用于軟骨缺損和退變治療具有重要意義。 目前，應(yīng)用IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs國內(nèi)外報道較少。為研究通過IGF-1基因轉(zhuǎn)染來促使MSCs向軟骨細(xì)胞分化，我們采用密度梯度離心法，與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，對存在于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞進行分離、純化和體外培養(yǎng)擴增，并對其生物學(xué)特性進行初步研究。通過構(gòu)建含有GFP和IGF-1基因的共表達(dá)載體，將IGF-1轉(zhuǎn)入MSCs，使MSCs向軟骨細(xì)胞分化，通過Ⅱ型膠原測定來判斷是否穩(wěn)定表達(dá)，以期為開展

4、IGF-1基因治療軟骨缺損的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： (一)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)活性觀察·1·1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進行體外培養(yǎng)擴增。 2.流式細(xì)胞儀檢測取P1代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進行分析、鑒定。 3.生物學(xué)性狀的觀察用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長情況并拍照。繪制P1、P3、P5代細(xì)胞生長曲線。 (二)胰島素樣

5、生長因子-1及綠色熒光蛋白雙表達(dá)載體的構(gòu)建1.質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1擴增純化。 2.pcDNA3.1-IGF-1質(zhì)粒的鑒定。 3.構(gòu)建pcGI重組質(zhì)粒。 4.pcGI重組質(zhì)粒的鑒定。 (三)胰島素樣生長因子-1基因修飾對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響 1.脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs及鑒定。 2.觀察轉(zhuǎn)染后MSCs，計算轉(zhuǎn)染效率。 3.Westernblot

6、測定IGF-1和Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)蛋白表達(dá)，采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件對凈灰度值進行方差分析。結(jié)果(一)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)成功1.細(xì)胞分離液分離后所得的細(xì)胞大多為圓形單個核細(xì)胞，原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞生長狀態(tài)良好。各代細(xì)胞形態(tài)基本一致，都為長梭形。 2.流式細(xì)胞儀檢測所得細(xì)胞CD105、CD166、CD29和CD44表達(dá)陽性，CD34、CD14和CD45表達(dá)陰性。 3.繪制P1、P3、P5代

7、次細(xì)胞生長曲線后，通過分析可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力變化不大。 (二)成功構(gòu)建了含有GFP和IGF-1基因的真核表達(dá)載體1.質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1擴增純化成功。 2.真核表達(dá)載體的酶切鑒定證實為pcDNA3.1-IGF-1內(nèi)含有IGF·2·1cDNA片段。 3.pcDNA3.1-IGF-1內(nèi)插入的IGF-1cDNA片段序列與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。 4.pcGI真核表達(dá)載體的酶切鑒

8、定表明所構(gòu)建的質(zhì)粒方向及大小正確。 (三)經(jīng)IGF-1基因修飾的MSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白1.脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞可激發(fā)出綠色熒光。 2.轉(zhuǎn)染后24h基因轉(zhuǎn)染效率約為(30±2.5)％。 3.Westernblot測定IGF-1表達(dá)和Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)蛋白表達(dá)凈灰度值轉(zhuǎn)染組明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組。 結(jié)論： 1.密度梯度離心法