三七皂苷影響動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞形成的物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致的心腦血管疾病是當(dāng)今人類(lèi)死亡的首要原因。雖然AS的概念已提出近百年，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。AS的發(fā)生是一個(gè)多種因素在多層次上綜合作用的過(guò)程。血脂水平的升高伴隨著促炎因子的表達(dá)和免疫反應(yīng)的激活，單核細(xì)胞活化成為巨噬細(xì)胞，血管壁脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致大量ox-LDL生成，巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬ox-LDL及其一系列信號(hào)分子的表達(dá)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝的障礙，并最終形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是AS早期變化的特征性標(biāo)志，巨噬泡沫細(xì)胞的形成

2、及其作用是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊損傷形成、發(fā)展和崩解的關(guān)鍵。因此，在調(diào)脂抗炎的同時(shí)，影響巨噬泡沫細(xì)胞的形成作為AS治療的新策略日益受到重視。 三七皂苷(PNS)是從三七根部提取的有效成分，主要含人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1等。我室既往的研究證實(shí)，PNS能通過(guò)炎癥免疫調(diào)節(jié)、增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性、抗自由基等機(jī)制發(fā)揮防治AS的作用。但是藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制的不明確成為制約PNS充分、合理應(yīng)用的重要因素。因此，立足于PNS的

3、有效性，以現(xiàn)代藥理研究方法和新技術(shù)為平臺(tái)，我們以巨噬泡沫細(xì)胞形成這一脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)相互交匯的AS早期事件為切入點(diǎn)，研究了PNS單體及其單體配伍對(duì)AS過(guò)程中泡沫細(xì)胞形成的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 1.32只雄性日本大白兔，隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、AS模型組、PNS低劑量組、PNS高劑量組，分別用下列飼料喂養(yǎng)：(1)基礎(chǔ)飼料，(2)高脂飼料，(3)高脂飼料+低劑量：PNS(60mg/kg)，(4)高脂飼料+高

4、劑量PNS(120mg/kg)。實(shí)驗(yàn)周期12w。通過(guò)測(cè)定血清中TC、TG、LDL、MDA水平、SOD活性、主動(dòng)脈蘇丹Ⅳ染色及主動(dòng)脈組織切片HE染色確定家兔AS模型的建立、泡沫細(xì)胞的形成及PNS的影響。 2.收集昆明種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)與純化后，分為5組：(1)對(duì)照組，(2)模型組，(3)PNS低劑量組(20μg·ml-1)，(4)PNS中劑量組(40μg·ml-1)，(5)PNS高劑量組(80μg·ml-1)。各組細(xì)胞置5％

5、CO2、37℃孵箱培養(yǎng)72h。油紅O染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，用酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TC及FC，Lowry法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。 3.正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取皂苷單體Rg1、Rb1、R1為考察因素，每個(gè)因素各選擇10-4、10-5、10-6M三個(gè)劑量為考察水平，以膽固醇酯為指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，分別確定皂苷單體Rg1、Rb1、R1及其配伍對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響。 4.收集昆明種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)與純化后，分為7組：對(duì)照組、模

6、型組、PNS(80μg·ml-1)組、單體配伍組(含10-5MR1、10-5MRg1、10-6MRb1)、R1(10-5M)組、Rg1(10-5M)組和Rb1(10-6M)組。各組細(xì)胞置5％CO2、37℃孵箱培養(yǎng)72h。RT-PCR方法測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)ACAT-1mRNA、AdipophilinmRNA、ABCA1mRNA、CD36mRNA和LXRαmRNA表達(dá)；用Westernblot方法測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)CD36蛋白表達(dá)。 結(jié)果：

7、 1.AS模型兔主動(dòng)脈內(nèi)膜下大量泡沫細(xì)胞積聚，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著增加；高劑量PNS可明顯減少泡沫細(xì)胞的形成，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積(p＜0.01)。 2.AS模型組家兔血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)；與AS模型組相比，高劑量PNS能非常顯著降低TC、TG、LDL-C水平(p＜0.01)，低劑量PNS能顯著降低家兔血清中TC水平(p＜0.05)，TG、LDL-C水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p

8、＞0.05)。 3.AS模型組動(dòng)物血清中MDA水平明顯升高(p＜0.01)，SOD活性明顯下降(p＜0.01)；PNS高劑量組血清中MDA水平明顯低于AS模型組(P＜0.01)，而SOD活性顯著升高(p＜0.01)；PNS低劑量組血清中MDA水平低于AS模型組(p＜0.05)，而SOD活性無(wú)明顯升高。 4.體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，未經(jīng)處理的細(xì)胞形態(tài)多呈梭形，油紅O染色無(wú)著色；與ox-LDL共培養(yǎng)后，油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞遍布，且

9、細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)多呈圓形或不規(guī)則形；PNS中、高劑量組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞比模型組明顯減少，形態(tài)漸趨正常，而PNS低劑量組細(xì)胞與模型組相比無(wú)明顯變化。 5.模型組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平呈顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，且CE/TC有顯著性差異(p＜0.01)；與模型組相比，PNS高、中劑量組細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平及CE/TC均有顯著性降低(p＜0.01)，PNS低劑量組除TC、CE顯著降低外(p＜0.01)，其它

10、無(wú)明顯變化；PNS各劑量組間細(xì)胞內(nèi)TC、FC、CE水平及CE/TC均有顯著性差異(p＜0.01)。 6.正交實(shí)驗(yàn)表明，皂苷單體R1、Rg1、Rb1效應(yīng)均顯著，并且R1×Rb1和Rg1×Rb1的交互作用顯著(p＜0.01)，其最佳單體配伍組合是：Rg1:R1:Rb1=10-5:10-5:10-6M。 7.PNS單體配伍能顯著降低與ox-LDL共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中CE/TC(％)值，與高劑量PNS相比無(wú)顯著差異。 8.0

11、x-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞CD36mRNA表達(dá)顯著增加(p＜0.01)；PNS組和單體配伍組均能非常顯著地降低CD36mRNA表達(dá)(p＜0.01)，Rg1、R1組可顯著降低CD36mRNA表達(dá)(p＜0.05)，Rb1組無(wú)顯著性差異(p＞0.05)；與PNS組相比，單體配伍組、Rg1組、R1組無(wú)顯著性差異。 9.0x-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞AdipophilinmRNA表達(dá)顯著增加(p＜0.01)；與模型組相比，PNS組、單體配伍組、Rg

12、1、Rb1、R1組AdipophilinmRNA的表達(dá)與模型組無(wú)顯著差異。 10.模型組LXRαmRNA表達(dá)顯著增加(p＜0.05)；PNS組和單體配伍組、Rg1、R1組均能非常顯著地增加LXRαmRNA表達(dá)(p＜0.01)，Rb1組無(wú)顯著性差異(p＞0.05)；與PNS組相比，單體配伍組無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，Rg1組有顯著性差異(p＜0.05)，R1、Rb1組有非常顯著差異(p＜0.01)。 11.模型組ABC

13、A1mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(p＜0.05)；與模型組相比，PNS組、單體配伍組均能非常顯著地增強(qiáng)ABCA1mRNA表達(dá)(p＜0.01)，R1組可顯著增加ABCA1mRNA表達(dá)(p＜0.05)，且三組之間無(wú)顯著差異。 12.模型組ACAT-1mRNA表達(dá)顯著增加(p＜0.01)；PNS組、單體配伍組和Rb1組均能非常顯著地降低ACAT-1mRNA表達(dá)(p＜0.01)，且三組之間無(wú)顯著性差異。 13.模型組CD36蛋白

14、表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)；PNS組與單體配伍組CD36蛋白表達(dá)量較模型組有顯著性降低(p＜0.01)，Rg1、R1組CD36蛋白表達(dá)量較模型組明顯減少(p＜0.05)；與PNS組相比，單體配伍組、Rg1組和R1組無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。 結(jié)論： 1.PNS通過(guò)減輕氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血脂水平和抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能，防治家兔實(shí)驗(yàn)性AS和泡沫細(xì)胞的形成。 2.PNS、PNS單體配伍均能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的

15、巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成。 3.PNS與PNS單體配伍下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的CD36mRNA、ACAT-1mRNA表達(dá)及CD36蛋白表達(dá)，上調(diào)ABCA1mRNA、LXRαmRNA的表達(dá)；Rg1可下調(diào)CD36mRNA及CD36蛋白表達(dá)、上調(diào)LXRαmRNA表達(dá)；Rb1下調(diào)ACAT-1mRNA表達(dá)；R1下調(diào)CD36mRNA及CD36蛋白表達(dá)、上調(diào)ABCA1mRNA、LXRαmRNA的表達(dá)，從而減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，促進(jìn)其外流，從