缺氧誘導(dǎo)因子-1α相關(guān)分子影響動脈粥樣硬化斑塊形成及穩(wěn)定性的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　論文Ⅰ 脯氨酸羥化酶3對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:
　　1.通過對ApoE-/-小鼠轉(zhuǎn)染攜帶PHD3的慢病毒，探究PHD3對AS斑塊形成的影響;
　　2.探究PHD3對AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及膠原的影響;
　　3.通過體內(nèi)外實驗探究PHD3對內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其相關(guān)信號通路;
　　方法:
　　1.構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模

2、型
　　將100只6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為5組（每組20只），分別為普通飲食組（control組）、高脂組（HFD組）、PHD3高表達(dá)慢病毒干預(yù)組（lv-PHD3組）、PHD3-shRNA干預(yù)組（Sh-PHD3組）和慢病毒空載體干預(yù)組(NC組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對lv-PHD3組、sh-PHD3組和NC組小鼠分別注射PHD3-1entivirus慢病毒、PHD3-shRNA慢病毒和空載體慢病毒（2×107TU/只

3、）。轉(zhuǎn)染2周后取材，制備冰凍切片，檢測病毒轉(zhuǎn)染效率。喂養(yǎng)12周后，小鼠預(yù)先禁食12小時后稱重，用0.8％戊巴比妥腹腔注射麻醉，心臟取血，離心后取上清保存于-80度冰箱。用生理鹽水沖洗小鼠的心臟和主動脈，防止血液殘留。部分小鼠繼以4％多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定。剝離小鼠心臟和主動脈，部分放入4％多聚甲醛固定，其余動物標(biāo)本保存于-80度冰箱。
　　2.主動脈表面AS病變?nèi)旧?br>　　將浸泡于4％多聚甲醛中的組織取出，從主動脈弓到腹主動脈分叉

4、處剝離周圍結(jié)締組織成分，延主動脈小彎一側(cè)剖開組織并展開固定于蠟板上，用油紅O染液染色30分鐘，紅色區(qū)域為被染色的AS斑塊。AS的病變嚴(yán)重程度用斑塊占整個主動脈表面積的百分比表示。
　　3.主動脈根部AS病灶分析
　　以6μm的厚度連續(xù)切小鼠主動脈根部，做平行于瓣環(huán)的冰凍切片，后對斑塊內(nèi)結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行染色，如蘇木素-伊紅染色和油紅O染色，以此分析主動脈根部的形態(tài)及檢測主動脈根部的斑塊面積。病變的嚴(yán)重程度用總斑塊面積占整個瓣環(huán)面

5、積的比例表示。
　　結(jié)果:
　　1.各組小鼠的一般情況
　　在處死動物前，對高脂組、lv-PHD3組、sh-PHD3組及NC組中小鼠的體重、血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示以上指標(biāo)在各組中并不存在濃度差異(P＞0.05)。這表明PHD3病毒轉(zhuǎn)染并不影響小鼠體內(nèi)整體的脂質(zhì)代謝。
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染后PHD3在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示，與control組對比，H

6、FD組斑塊中PHD3表達(dá)升高(P＜0.05)。與NC組對比，PHD3 lentivirus轉(zhuǎn)染組小鼠斑塊中PHD3表達(dá)顯著增高，而PHD3-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組小鼠斑塊中PHD3顯著減少（P均＜0.05）。Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。這一結(jié)果表明，PHD3病毒可有效干預(yù)小鼠主動脈根部斑塊中PHD3的表達(dá)。
　　3.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對主動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響
　　小鼠主動脈大體油紅O染色顯示，HFD

7、組較control組斑塊面積顯著增加(P＜0.05);與NC組比較，lv-PHD3組斑塊面積顯著增加(P＜0.05)，而sh-PHD3組斑塊面積明顯減少(P＜0.05)。主動脈根部橫切面油紅O染色結(jié)果與大體油紅O染色結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，PHD3過表達(dá)可增加小鼠主動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)的積聚，而抑制PHD3后斑塊內(nèi)脂質(zhì)積聚減少。
　　結(jié)論:
　　1.PHD3過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可加速AS斑塊的形成，而抑制PHD3則可減少斑塊的形成;<

8、br>　　2.PHD3通過增加動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤和平滑肌細(xì)胞遷移促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成;
　　3.PHD3過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可促進(jìn)AS斑塊內(nèi)VCAM-1和ICAM-1的表達(dá);
　　4.MAPK信號通路介導(dǎo)了PHD3對內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　論文Ⅱ 內(nèi)臟脂肪素對斑塊穩(wěn)定性的影響及其機(jī)制研究
　　目的：
　　1.通過visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染，明確visfatin高表達(dá)對AS斑塊穩(wěn)定性的影響
　　

9、2.探討visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染對AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、脂質(zhì)積聚、平滑肌細(xì)胞以及膠原纖維的影響;
　　3.探討visfatin促進(jìn)AS斑塊中MMP-8表達(dá)的相關(guān)信號通路。
　　方法：
　　1.構(gòu)建動物模型
　　80只6周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，對小鼠行頸動脈套管，套管位置在左頸總動脈處。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后，隨機(jī)將小鼠分為2組（每組40只），分別為lenti-visfatin組和lenti-nul

10、l組。Lenti-visfatin組給予1×107 TUvisfatin高表達(dá)慢病毒局部浸潤，lenti-null組給予1×107 TU空載體病毒局部浸潤。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后，小鼠預(yù)先禁食12小時后稱重，用0.8％戊巴比妥腹腔注射麻醉，心臟取血，離心后取上清保存于-80度冰箱。用生理鹽水沖洗小鼠的心臟和主動脈，防止血液殘留。部分小鼠繼以4％多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定。剝離小鼠頸動脈，部分放入4％多聚甲醛固定，其余動物標(biāo)本保存于-80度冰箱。

11、　　2.血清學(xué)檢測
　　檢測小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。
　　3.頸動脈油紅O染色
　　以6μm的厚度連續(xù)切小鼠頸動脈，并進(jìn)行油紅O染色，以此分析頸動脈處斑塊內(nèi)脂質(zhì)的聚集。病變的嚴(yán)重程度用油紅O陽性染色區(qū)域面積占整個頸動脈面積的比例表示。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠的體重及血清學(xué)檢測指標(biāo)
　　lenti-null組和lenti-visfatin組小鼠在血清TC、TG、

12、LDL-C和HDL-C水平不存在顯著性差異(P＞0.05)，表明lenti-visfatin的局部轉(zhuǎn)染并不影響小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝水平。
　　2.Visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染后在頸動脈斑塊內(nèi)表達(dá)的檢測
　　在轉(zhuǎn)染后的第3天，組織內(nèi)mRNA水平明顯升高(P＜0.05)，而蛋白水平卻無明顯變化(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染后第7天，組織內(nèi)mRNA水平和蛋白水平均明顯升高(P＜0.05)。4周后，lenti-visfatin組中visfatin

13、的表達(dá)仍然顯著高于lenti-null組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染成功上調(diào)了小鼠頸動脈組織中visfatin的表達(dá)。
　　3.Visfatin在頸動脈斑塊內(nèi)主要表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞
　　visfatin和巨噬細(xì)胞免疫熒光共定位結(jié)果顯示，在頸動脈斑塊內(nèi)，visfatin的綠色熒光與巨噬細(xì)胞的紅色熒光存在高度重合區(qū)域，而在非MOMA-2陽性區(qū)域也存在少量綠色熒光，表明visfatin主要來源于斑塊

14、內(nèi)的巨噬細(xì)胞，少量表達(dá)于其他細(xì)胞中。
　　4.Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響
　　對小鼠頸動脈冰凍切片行MOMA-2染色。結(jié)果顯示，lenti-visfatin組與lenti-null組相比，巨噬細(xì)胞占斑塊面積的比例顯著增加(P＜0.05)，表明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集明顯增加。
　　5.Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對頸動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響對小鼠頸動

15、脈冰凍切片行油紅O染色，檢測頸動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)的聚集情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lenti-visfatin組與lenti-null組相比，脂質(zhì)占頸動脈斑塊面積的比例明顯升高（P＜0.05=，說明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集明顯增加。
　　6.Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對頸動脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的影響
　　對小鼠頸動脈冰凍切片行α-SMA染色，檢測斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的聚集情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lenti-visfa

16、tin組與lenti-null組相比，平滑肌細(xì)胞占頸動脈斑塊的面積明顯減少（P＜0.05=，表明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞數(shù)目減少。
　　結(jié)論:
　　1.visfatin與實驗性小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān);
　　2.visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染可顯著降低AS斑塊的穩(wěn)定性;
　　3.visfatin可促進(jìn)MMP-1、2、8、9的表達(dá)，且呈劑量和時間依賴性;
　　4.visfat