肌肽對(duì)腦缺血性興奮性損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、組胺是一種體內(nèi)廣泛存在的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)。它在許多中樞神經(jīng)活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如覺(jué)醒—睡眠、痛覺(jué)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、飲水?dāng)z食調(diào)節(jié)、體溫調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)以及學(xué)習(xí)記憶等。同時(shí)有研究表明組胺可能參與了腦缺血的過(guò)程，它對(duì)缺血過(guò)程中由于NMDA受體過(guò)度激活而引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。大鼠腦缺血后給予組胺的前體物質(zhì)組氨酸，能夠減輕大鼠紋狀體部位神經(jīng)元的損傷。相反，α—fluoromethylhistidine(α—FMH)，一種不可逆的組氨酸脫

2、羧酶的抑制劑，能顯著性地增加大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的壞死。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)組胺在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上具有明顯的抗興奮性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。然而，組胺本身是一種炎癥介質(zhì)，可能會(huì)引起一些炎癥反應(yīng)；同時(shí)它也不能通透血腦屏障，這些都限制了組胺在臨床上成藥的可能性。因此，尋找一些既具有組胺樣的神經(jīng)保護(hù)功能，又能避免組胺的不良作用的藥物，對(duì)臨床上防治腦缺血具有重要的意義。 肌肽(β—丙氨酸-L-組氨酸)在一個(gè)世紀(jì)前就被前蘇聯(lián)學(xué)者G

3、ulewitsch和Amiradzibi從牛肉提取物中檢測(cè)到。肌肽在生物體內(nèi)的分布比較廣泛，如骨骼肌、腦、心臟、腎臟等。肌肽具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)生理pH值、抗炎癥、抗糖基化，在嗅球區(qū)還可能起著神經(jīng)遞質(zhì)的功能。但是迄今為止，肌肽在腦內(nèi)的生理功能還是不很清楚。 另一方面，有報(bào)道肌肽能在肌肽酶和組氨酸脫羧酶的作用下代謝生成組胺，同時(shí)也能通過(guò)組胺的Hl受體起到一個(gè)神經(jīng)保護(hù)作用。鑒于肌肽和組胺之間的這種關(guān)系，我

4、們首次提出在腦內(nèi)是否存在肌肽—組氨酸—組胺這樣一條代謝通路?肌肽能否通過(guò)這樣一條代謝通路從而代替組胺，成為一個(gè)在臨床上治療腦缺血的有效藥物?所以本課題探討了肌肽對(duì)NMDA誘導(dǎo)的分化的PC12細(xì)胞興奮性損傷以及組氨酸脫羧酶基因敲除小鼠的永久性局灶性腦缺血的作用，試圖闡明肌肽的保護(hù)作用及其與組胺的相關(guān)性。 1、肌肽對(duì)NMDA誘導(dǎo)的分化的PC12細(xì)胞興奮性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肌肽預(yù)處理能顯著降低由NMDA

5、誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的死亡率；Hoechst33342和PI的核雙染實(shí)驗(yàn)同時(shí)也顯示了肌肽能明顯降低NMDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡和壞死。肌肽預(yù)處理能顯著降低胞外谷氨酸的含量，同時(shí)能提高PC12細(xì)胞內(nèi)組氨酸脫羧酶的活力，顯著提高胞內(nèi)胞外肌肽、組氨酸、組胺的含量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肌肽的這種保護(hù)作用能被對(duì)組氨酸脫羧酶的選擇性且不可逆的抑制劑α—FMH所逆轉(zhuǎn)；同時(shí)這種保護(hù)作用也能夠被組胺H1受體拮抗劑吡拉明(pyrilamine)和組胺H3受體拮

6、抗劑thioperamide所逆轉(zhuǎn)。Thioperamide逆轉(zhuǎn)肌肽的保護(hù)作用可能與它能逆轉(zhuǎn)肌肽對(duì)谷氨酸的抑制作用相關(guān)。因此，研究提示在PC12細(xì)胞內(nèi)存在肌肽—組氨酸—組胺這條代謝通路，肌肽對(duì)NMDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制主要是通過(guò)肌肽—組氨酸—組胺這條代謝通路和H1/H3受體介導(dǎo)的，此外還可能與其抑制谷氨酸水平的作用有關(guān)。本研究顯示肌肽可能是一種潛在的抗興奮性損傷的藥物。 2、肌肽對(duì)小鼠永久性局灶性腦缺血的保護(hù)作用及

7、其機(jī)制 在NGF誘導(dǎo)分化的PC12細(xì)胞興奮性損傷模型上我們發(fā)現(xiàn)了肌肽的保護(hù)作用通過(guò)了肌肽—組氨酸—組胺這條代謝通路。那么，肌肽及這條代謝通路在整體動(dòng)物的腦缺血模型中是否也有作用?為了進(jìn)一步驗(yàn)證肌肽及其代謝通路的作用，我們利用組氨酸脫羧酶基因敲除(缺乏組胺的合成酶，即阻斷組氨酸—組胺代謝通路，長(zhǎng)期缺乏組胺)小鼠及它的野生型小鼠來(lái)觀察肌肽在永久性局灶性腦缺血中的作用及這條代謝通路在其中的作用。于術(shù)前30min腹腔內(nèi)給與肌肽750mg

8、/kg均能使組氨酸脫羧酶基因敲除小鼠和它的野生型小鼠的神經(jīng)功能得到改善，梗死體積減少；肌肽的這種保護(hù)作用在兩種小鼠上沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肌肽能使小鼠腦內(nèi)谷氨酸的水平降低，并能維持小鼠缺血后腦內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1的表達(dá)。在原代培養(yǎng)的皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外缺糖缺氧(oxygen—glucosedeprivation，OGD)模擬在體缺血的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭型瑯幼C實(shí)了肌肽對(duì)谷氨酸釋放(或再攝取)及其GLT-1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。另外，在星形膠質(zhì)細(xì)胞

9、上肌肽能抑制OGD導(dǎo)致的線粒體內(nèi)活性氧自由基(ROS)的大量生成和線粒體膜電勢(shì)的喪失。肌肽還能降低魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS生成，抑制GLT-1的表達(dá)下調(diào)。我們的結(jié)果表明無(wú)論組氨酸脫羧酶基因敲除與否都不影響肌肽對(duì)小鼠永久性局灶性腦缺血的保護(hù)作用。因此，肌肽對(duì)小鼠在體腦缺血的保護(hù)作用可能不是通過(guò)組胺，而是與它能有效地調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1和降低谷氨酸水平的作用相關(guān)。 總之，本課題發(fā)現(xiàn)了肌肽—組氨酸—