NOX2調(diào)控的ComplexinⅡ在缺血性中風(fēng)后谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性中的作用及機制.pdf

1、研究背景和目的:谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高的興奮性氨基酸，盡管缺血性腦損傷的病理生理機制至今尚未完全明確，有足夠的證據(jù)證明谷氨酸介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性參與了這一損傷過程。作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，生理情況下谷氨酸通過SNARE復(fù)合體介導(dǎo)的方式由突觸前膜釋放至突觸間隙，SNAREs(solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein receptor，可溶性N-己基順丁烯二酰亞

2、胺敏感因子結(jié)合蛋白）是由突觸囊泡膜蛋白(vesicle-associated membraneprotein，VAMP)、突觸膜蛋白(soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachmentprotein-25，SNAP25)和突觸融合蛋白-1（Syntaxin-1）組成的多元復(fù)合體?，F(xiàn)已明確，突觸以鈣依賴性胞裂外排方式釋放神經(jīng)遞質(zhì)依賴于SNARE復(fù)合體的裝配過程，而這種裝配過程又受其結(jié)合

3、蛋白的影響，其中Complexins的作用非常重要。但在Complexins調(diào)控下SNARE復(fù)合體介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程是否在缺血性腦損傷中發(fā)揮作用，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報道。
　　由于目前尚未發(fā)現(xiàn)針對Complexins的特異性阻斷劑，我們通過研究Complexins及其介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性機制與引起腦缺血再灌注損傷的其他病理生理機制之間的關(guān)系來尋找干預(yù)Complexins通路的有效治療措施。眾所周知，自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激途徑也

4、是腦缺血再灌注損傷的重要病理生理機制，另有證據(jù)表明，在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，抗氧化劑會逆轉(zhuǎn)Complexins的表達(dá)變化，據(jù)此我們推測在腦缺血再灌注損傷中，Comlexins-SNARE復(fù)合體介導(dǎo)的興奮性氨基酸谷氨酸釋放的機制有可能受氧化應(yīng)激機制調(diào)控。
　　方法:采用大腦中動脈阻塞法建立局灶性腦缺血及再灌注損傷模型，并通過細(xì)胞糖氧剝奪法建立腦皮層神經(jīng)細(xì)胞缺血及再灌注損傷模型，體內(nèi)外分別應(yīng)用基因敲低和RNA干擾等方法來研究SNARE復(fù)

5、合體調(diào)控蛋白Complexins在缺血性腦損傷中的作用。通過行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、高效液相熒光、免疫組織化學(xué)等方法，觀察腦缺血及再灌注損傷后Complexins的表達(dá)變化，并明確其對腦缺血再灌注損傷后SNARE復(fù)合體及谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性的影響。為了尋求對Complexins在缺血性腦損傷后作用的有效干預(yù)途徑，我們通過使用NOX2基因敲除動物以及體外RNA干擾等方法研究了缺血性腦損傷后Complexins介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性機制受

6、NADPH氧化酶NOX2催化亞基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。
　　結(jié)果:與假手術(shù)對照組相比，缺血腦組織皮層半暗帶中ComplexinⅠ和ComplexinⅡ的表達(dá)均顯著升高。由于ComplexinⅡ主要定位于興奮性神經(jīng)突觸，對于興奮性氨基酸谷氨酸的釋放具有更為重要的作用，本研究繼而使用攜有靶向Complexin-Ⅱ shRNA的慢病毒進(jìn)行體內(nèi)外基因敲低，進(jìn)一步明確了ComplexinⅡ在缺血性腦損傷及SNARE復(fù)合體的裝配和谷氨酸興

7、奮性神經(jīng)毒性中的作用。體外實驗的結(jié)果也驗證了這一過程。進(jìn)一步利用NOX2基因敲除動物以及體外RNA干擾等方法，我們發(fā)現(xiàn)NOX2基因缺失可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷，并可以逆轉(zhuǎn)谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性及ComplexinⅡ的表達(dá)。
　　結(jié)論:本課題首次揭示了Complexins在缺血性腦損傷后谷氨酸介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性機制中的作用和分子生物學(xué)機制，有望為充實、完善缺血性腦損傷的病理生理學(xué)機制提供新的內(nèi)容，并首次證明了該作用受NADPH氧