重組腺病毒伴隨病毒AAV攜帶人GDNF基因?qū)Υ笫蠹顾枭窠?jīng)元損傷保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺病毒伴隨病毒AAV攜帶人GDNF基因?qū)Υ笫蠹顾枭窠?jīng)元損傷保護(hù)作用及其機(jī)制研究姓名：焦建偉申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：林嘉友;田竟生2000.5.1中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 3體p T A R G E T —h G D N F ( ±) 轉(zhuǎn)染B H K 一2 1 細(xì)胞，W e s t e m ·b l o t 和免疫組織化學(xué)的結(jié)果證明p T A R G E T —h G

2、 D N F ( + ) 轉(zhuǎn)染后的B H K 一2 1 細(xì)胞可以表達(dá)重組人G D N F 蛋白，E L I S A 結(jié)果表明：每毫升細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有2 n g 重組人G D N F 蛋白。用轉(zhuǎn)染了p T A R G E T —h G D N F ( + ) 質(zhì)粒D N A 的B H K 一2 1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)p c l 2 細(xì)胞吱二、p S N A V ．h G D N F 載體構(gòu)建、r A A V ．h G D N F 病毒

3、包裝及滴度的測定本部分研究實驗依據(jù)是：r H S V ．r c 病毒可以輔助A A V 病毒的包裝，并且能為A A V 的包裝提供反式作用基因r e p 和c a p 。用這種r H S V ．r e 病毒感染A A v 載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，就會包裝出重組的A A V 病毒顆粒。f 這種新型的具有A A V 病毒包裝功能的r H S V ．r c 輔助病毒，簡化了傳統(tǒng)A A V 病毒的包裝方法。在本實驗中，我們將人G D N F 基因重組到

4、A A V 質(zhì)粒載體p S N A V的兩個I T R s 序列之間，構(gòu)建成含有人G D N F 基因的p S N A V - h G D N F 重組質(zhì)粒載體。用此載體轉(zhuǎn)染B H K ．2 l 細(xì)胞，在一定的選擇壓力下培養(yǎng)，挑選單個細(xì)胞克隆，建立A A V t B H K ．h G D N F 包裝細(xì)胞系。用r H S V —r c 輔助病毒感染該細(xì)胞系就會包裝出r A A V - h G D N F 病毒。D o t —b l o

5、t 鑒定結(jié)果顯示：在一定選擇壓力下培養(yǎng)，篩選出的7 株細(xì)胞中有5 株細(xì)胞可以包裝出r A A V - h G D N F 病毒。用S l o t ．b l o t 檢測r A A V 。h G D N F 的病毒滴度為1 ×1 0 i t ／m 1個病毒顆粒。同時，我們用含有報告基因的r A A V —G F P 病毒感染B H K 一2 1細(xì)胞，結(jié)果顯示：含有報告基因的重組A A v 病毒可以感染細(xì)胞，并且可以在細(xì)胞中表達(dá)綠

6、色熒光蛋白。L三、r A A V —h G D N F 對原代培養(yǎng)大鼠胚胎脊髓神經(jīng)元的活性研究我們發(fā)現(xiàn)用r A A V ．h G D N F 感染原代培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元可以顯著抑制谷氨酸鈉誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元的死亡。同時我們運用半定量R T - P C R 的方法，以B ．a(chǎn) c t i n 為內(nèi)對照，檢測脊髓神經(jīng)元內(nèi)N O Sm R N A 的表達(dá)。f 結(jié)果顯示：r A A V —h G D N F 可以抑制谷氨酸鈉誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元N O Sm