軟組織小圓細胞肉瘤分子診斷技術(shù)條件的建立和優(yōu)化.pdf

1、目的：應(yīng)用多重RT-PCR技術(shù)檢測軟組織小圓細胞肉瘤的融合基因的表達，為臨床小圓細胞腫瘤的診斷提供有力的分子依據(jù)和簡便的診斷方法。同時對石蠟包埋腫瘤組織中的組織處理、核酸提取進行探索。建立并優(yōu)化一套穩(wěn)定、高效的診斷惡性軟組織小圓細胞腫瘤的分子診斷技術(shù)方法。 方法：收集石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科及新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院30年間(1968年-2005年)軟組織小圓細胞腫瘤43例，其中20例尤因氏肉瘤/原始神經(jīng)外胚層瘤(ES

2、/PNET)，5例低分化和上皮為主型滑膜肉瘤(SS)，9例腺泡狀橫紋肌肉瘤(ARMS)，3例粘液脂肪肉瘤，6例胚胎型橫紋肌肉瘤。對照組22例，包括10例惡性B細胞性淋巴瘤，1例神經(jīng)母細胞瘤，¨例雙相型和單相纖維型SS。結(jié)合PrimerPrimier5和Oligo6.0軟件及引物設(shè)計原則設(shè)計多重引物，應(yīng)用多重巢式RT-PCR技術(shù)檢測EWS-FLI、PAX3-FKHR、SYT-SSX融合基因的表達，并將其與傳統(tǒng)的RT-PCR進行比較。另外收

3、集石蠟包埋軟組織腫瘤及淋巴瘤50例，分別應(yīng)用Trizol和AGPC法提取RNA，來比較兩種提取方法。收集新鮮腫瘤組織8例，用PBS緩沖液配制的10％中性福爾馬林固定液進行6小時、12小時、24小時不同時間的固定，比較它們的核酸含量和組織形態(tài)學(xué)，同時將PBS緩沖液配制的10％中性福爾馬林固定液與臨床使用的福爾馬林固定液進行了比較，從而尋找出既能保證組織形態(tài)學(xué)完好性又能更好的保存組織中核酸含量的固定方法。 結(jié)果：經(jīng)測序證實，43例中

4、檢出融合基因陽性24例，其中20例ES/PNET中14例EWS-FLI1陽性(70％)、9例ARMS中6例PAX3-FKHR陽性(66.7％)、5例SS中4例SYT-SSX陽性(80.0％)，3例粘液脂肪肉瘤，6例胚胎橫紋肌肉瘤均未檢測出以上三種融合基因，證實多重RT-PCR與傳統(tǒng)RT-PCR的陽性檢出率一致，同時與傳統(tǒng)的RT-PCR相比較，具有節(jié)省成本、縮減時間、減少實驗工作量等優(yōu)點。對照組中除11例SS中有7例檢測到SYT-SSX融

5、合基因外，其余均未檢測出任何特異性融合基因表達。 Trizol法提取RNA成功率為47/50(96％)，AGPC法陽性率為46/50(94％)，其OD值(Trizol1.72±0.02和AGPC1.71±0.03)及RNA的得率(Trizol和AGPC分別為5.823μg、5.175μg/15張蠟?zāi)?在統(tǒng)計學(xué)上均無明顯差異。在4℃10％中性福爾馬林固定液(Ph為7.2-7.4)固定的組織，固定12小時與固定6小時后提取RNA的質(zhì)

6、量統(tǒng)計學(xué)無顯著差異(P=0.261)、12小時與24小時、6小時與24小時OD值比較統(tǒng)計學(xué)有顯著差異，6小時、12小時、24小時的RNA平均產(chǎn)率分別為4.091μg、3.36μg、2.79μg/15張蠟?zāi)ぃ梢钥闯鲭S著固定時間的增加RNA得率降低。PBS緩沖液配制的10％中性福爾馬林固定液所提取的RNA與臨床常規(guī)使用的固定液所提取的RNAOD值無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)，但前者RNA得率(3.36μg/15張蠟?zāi)?比后者(2.92

7、μg/15張蠟?zāi)?高。 結(jié)論：1)多重RT-PCR技術(shù)對診斷軟組織小圓細胞腫瘤中特異性融合基因的表達是一種敏感、特異、快速、可靠的方法，為臨床疑難病例的診斷提供了有效技術(shù)手段；2)在固定組織時4℃，10％中性福爾馬林固定液(Ph為7.2-7.4)固定12小時能更有效的保持組織形態(tài)學(xué)和核酸含量；3)Trizol能夠提取高質(zhì)量的RNA，與其相比AGPC方法在花費和消耗上比Trizol低一半左右，是一種簡便、經(jīng)濟、適于大樣本石蠟組織標