高仿真組織工程神經修復材料的制備及應用研究.pdf

1、周圍神經再生和功能修復是尚未解決的臨床難題。對于短節(jié)段的神經損傷，可以將斷裂的神經直接對端吻合，使近端再生的神經纖維能長入遠端。但對于長節(jié)段的神經缺損，臨床上無法進行無張力縫合，目前治療的金標準是將未損傷區(qū)域的自體神經移植到損傷區(qū)域來橋接損傷的神經斷端。然而，應用自體神經移植受到很多因素限制：獲取供體神經需要二次手術，供區(qū)神經來源不足，繼發(fā)的供區(qū)神經功能喪失，以及供受神經在組織結構和尺寸上不匹配等。因此，研發(fā)能夠有效代替自體神經的移植替

2、代物是目前亟待解決的難題。
　　近年來，組織工程周圍神經成為研究的熱點。應用組織工程學方法制備組織工程移植物橋接長節(jié)段神經缺損收到較好療效，受到了越來越多的關注。組織工程移植物一般由生物支架材料、種子細胞和生物活性因子三部分構成。其中支架作為種子細胞和神經營養(yǎng)因子的載體，作為組成神經損傷修復微環(huán)境的主體，其構建和性能改進研究成為制約周圍神經損傷修復的關鍵。支架材料的組成及內部微結構是影響組織工程移植物修復長節(jié)段神經損傷的關鍵因素。

3、最近研究表明，內部具有定向微結構的支架，在橋接神經缺損時比無定向結構的支架更有利于引導再生軸突的定向生長，能夠促進再生神經纖維通過損傷區(qū)到達遠端，證實了支架內部結構的物理引導作用對于神經再生的重要性。分析原因，主要是因為其內部定向結構模擬了正常神經基底膜的軸向微管結構。但這些支架材料在原料組成以及內部結構上，與自體神經神經基底膜的組成和結構還有很大差距，需要進一步改進。
　　鑒于正常神經基底膜微管結構引導再生神經軸突定向生長的關鍵

4、作用，如能夠根據神經組織的真實組成和結構來選擇和制備組織工程支架，將能夠在一定程度上使該支架具備類似正常神經組織的特性，有可能會獲得最理想的移植替代修復結果。然而，到目前為止，僅有少數具有類似結構的支架被報道，而應用其在體內修復實驗動物長節(jié)段周圍神經缺損至今未見研究報道。
　　本實驗中，選用神經基底膜基質材料——膠原為支架的主要原料，應用改良的梯度冷凍干燥技術，制備具有軸向微管結構的三維多孔支架材料。該支架在組成及內部結構方面高度

5、仿真正常神經基底膜。隨后，從原料配比、冰醋酸濃度以及冷淋速度等三方面對改良的梯度冷凍干燥技術工藝進行對比研究，篩選出最佳的制備工藝指標。為了使支架能夠滿足體內移植的需求，應用新型低細胞毒性交聯劑——京尼平對支架進行化學交聯，改善其機械強度和降解速度，并確定其最佳交聯參數。在此基礎上，根據國家醫(yī)療器械生物學評價的標準和要求，對本支架進行細胞相容性和組織相容性評價，結果證實本支架材料具有良好的生物安全性，可用于體內移植修復。最后，應用免疫組

6、織學、透射電鏡、神經電生理、逆行示蹤技術以及評測坐骨神經指數等方法，從形態(tài)學和功能學兩方面綜合評價本支架橋接大鼠坐骨神經15mm缺損的修復效果，結果證實其療效接近自體神經移植。具體內容如下：
　　第一部分支架材料制備及最佳制備工藝參數確定
　　目的：構建組成及結構高度仿真的組織工程神經支架
　　方法：以細胞外基質主要成分——膠原為原料，應用改良的梯度冷凍干燥技術制備仿真支架，掃描電鏡觀察其結構，評測支架孔徑、孔隙率等基

7、本性能，優(yōu)化其制備參數。
　　結果：本實驗制備的支架材料在組成及內部結構方面高度仿真正常神經基底膜，具備以下優(yōu)點：長軸定向微管樣仿生三維結構與正常神經基底膜結構高度相似，利于引導再生軸突定向生長；微管內徑較為均一，管徑在25μm～55μm之間（平均值為37.41±11.0μm），適于神經軸突生長；平行微管間相互溝通的孔隙相連，溝通孔孔徑為20.68±4.61μm，利于營養(yǎng)物質和代謝產物的運輸；相對封閉的外壁結構，其壁厚為2.45±

8、1.43μm，此結構在神經再生過程中，將起到瘢痕屏障的作用，能夠在不影響營養(yǎng)物質交通的情況下，有效的阻止瘢痕纖維的長入，保護再生纖維的順利通過。
　　經過對比研究，確定了梯度冷凍干燥的制備最佳參數：膠原-殼聚糖混合比率為4：1，冰醋酸濃度為3mg/ml，梯度冷淋速度控制在2×10-5m/s的條件下，制備的支架材料具有最佳的三維仿生結構和良好的性能，支架平均孔隙率達90％以上。其平均孔徑在30μm左右，能夠滿足理想支架對孔徑的要求：

9、小到能夠物理性制約并有效引導再生軸突的定向生長；大到能夠支持有效的血管化和再生支持細胞的滲入。
　　第二部分支架材料改性及生物相容性評測
　　目的：改善支架的機械性能和降解性，適應體內移植需要，并進行相容性評價為體內移植提供實驗依據，奠定基礎。
　　方法：選用京尼平進行化學交聯改性，考量不同交聯條件下支架彈性模量、降解率等指標，優(yōu)化交聯參數；根據國家標準對支架的細胞相容性和組織相容性進行評價。
　　結果：本支架應

10、用低生物毒性交聯劑——京尼平（1wt％）交聯48小時處理后，無論在干或濕的狀態(tài)下，其拉伸應力均高于未交聯組，其彈性模量在濕的狀態(tài)下達3.938±1.326MPa，能夠維持三維空間結構，對抗組織塌陷，機械性能基本滿足在體移植需求。交聯處理后，無論是在陰性對照液PBS中還是溶菌酶溶液中，支架在各時間點上的重量丟失比率均小于未交聯組，交聯支架8周PBS（無溶菌酶）溶液降解率為17.9±4.2％，溶菌酶溶液中降解率為20.1±4.6％，支架材料

11、在神經再生過程中能夠保持穩(wěn)定的結構，配合神經軸突的再生。
　　經京尼平交聯的支架材料對小鼠L929成纖維細胞無直接毒性作用，其浸提液對細胞各時限的毒性評定級別均為0～1級，對細胞形態(tài)、生長和增殖不構成損害，肌肉植入法結果證實局部組織無不良反應，有良好的細胞相容性和組織相容性。
　　第三部分支架材料修復大鼠坐骨神經缺損有效性評價
　　目的：評價高仿真支架修復神經缺損的有效性。
　　方法：應用免疫組織學、透射電鏡、神

12、經電生理、逆行示蹤技術以及評測坐骨神經指數等方法，從形態(tài)學和功能學兩方面綜合評價本支架橋接大鼠坐骨神經15mm缺損的修復效果。
　　結果：形態(tài)學觀察結果顯示：移植術后4周膠原-殼聚糖支架仍能夠保持完整的軸向微管結構，平行的微管之間有大量再生神經纖維線性排列，沿軸向管壁定向生長；術后12周，支架材料幾乎完全降解吸收，被大量成束的再生神經纖維所替代，證實了再生的神經纖維長過了橋接段。透射電鏡結果：新生髓鞘比較纖細，結構完整，有許多無髓

13、神經纖維和大量由雪旺細胞包繞形成的有髓神經纖維共存，并可觀察到完整的再生血管結構和良好排列的髓鞘板層結構，再生神經軸突情況良好，修復效果接近自體神經移植。
　　功能學檢測結果顯示：支架材料組的運動神經傳導速度、潛伏期和波幅與自體神經移植結果接近，兩組之間差異無顯著性意義（p>0.05）；逆行示蹤標記后，在脊髓前角和背根神經節(jié)可檢測到與自體神經移植組數量相當的熒光金標記陽性神經元；坐骨神經指數結果也同樣證實，膠原-殼聚糖支架橋接的坐