血管、神經(jīng)組織工程

1、第七節(jié) 血管組織工程,一、血管的組織結(jié)構(gòu)(一)動(dòng)脈1、中動(dòng)脈 管壁平滑肌豐富、管壁收縮性強(qiáng)，又稱肌性動(dòng)脈。①內(nèi)膜 表面為內(nèi)皮，內(nèi)皮周圍有內(nèi)彈性膜。內(nèi) 皮和內(nèi)彈性膜之間，有較薄的內(nèi)皮下層，含少量膠原纖維、彈性纖維和少許縱行平滑肌。中動(dòng)脈的內(nèi)彈性膜明顯，此為內(nèi)膜和中膜的分界。,② 中膜 較厚，主要由10～40層環(huán)行排列的平滑 肌組成，平滑肌之間有一些彈性纖維和膠原纖 維。動(dòng)脈中膜含有平滑肌細(xì)胞，這

2、些平滑肌細(xì) 胞具有產(chǎn)生結(jié)締組織纖維和基質(zhì)的能力。 ③ 外膜 外膜的厚度與中膜相近，由較疏松的結(jié) 締組織組成，含有膠原纖維和彈性纖維。在外 膜與中膜交界處，有的中動(dòng)脈有較密集的彈性 纖維，有的有一層較明顯的外彈性膜。,2、大動(dòng)脈 管壁中有許多層彈性纖維，平滑肌較少，也稱為彈性動(dòng)脈。①內(nèi)膜 內(nèi)皮外有較厚的內(nèi)皮下層，其中含膠原纖 維、彈性纖維和一些平滑肌。內(nèi)皮下層之外為多層 彈

3、性膜，與中膜的彈性膜相連，故內(nèi)膜與中膜沒有 清楚的分界。②中膜 主要由多層彈性膜和一些平滑肌組成。成人 有40～70層彈性膜，各層彈性膜由彈性纖維相連。③外膜 較薄，致密的結(jié)締組織組成，沒有明顯的外 彈性膜。外膜逐漸移行為周圍較疏松的結(jié)締組織。,(三)動(dòng)脈血管內(nèi)皮的功能 血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成血管的光滑面，便于血液流動(dòng)。內(nèi)皮細(xì)胞能合成并向血液釋放多種有生物活性的物質(zhì)，如A、B血型抗原，Ⅷ因子，前列環(huán)素。正常時(shí)，抗凝

4、物質(zhì)占優(yōu)勢，使血液保持液體狀態(tài)，血管受損時(shí)，凝血物質(zhì)增多，參與凝血。,（二）靜脈 常與相應(yīng)動(dòng)脈伴行。靜脈管壁薄而柔軟，彈性也較小。靜脈壁內(nèi)平滑肌和彈性組織不及動(dòng)脈豐富，結(jié)締組織成分較多。1．中靜脈 內(nèi)膜薄，內(nèi)彈性膜不發(fā)達(dá)或不明顯。中 膜比相伴行動(dòng)脈薄，平滑肌束分布稀疏。外膜一 般比中膜厚，沒有外彈性膜，由結(jié)締組織組成， 有的中靜脈外膜可有縱行平滑肌束。,2．大靜脈 管壁內(nèi)膜較薄，中膜很不發(fā)達(dá)，為幾

5、 層排列疏松的環(huán)行平滑肌，甚至沒有平滑肌。 外膜則較厚，結(jié)締組織內(nèi)常有較多的縱行平滑 肌束。 3．靜脈瓣 管徑2 mm以上的靜脈常有瓣膜，防 止血液逆流。瓣膜為兩個(gè)半月形薄片，彼此相 對，根部與內(nèi)膜相連，其游離緣朝向血流方 向，為含彈性纖維的結(jié)締組織。,二、血管移植的發(fā)展1、靜脈移植 運(yùn)用自體靜脈作為動(dòng)脈搭橋的替代品。2、異種或同種異體血管移植 易發(fā)生動(dòng)脈瘤和移植后感染。3、人工合成

6、血管移植 目前常用的人工血管有滌綸織物、膨脹性聚四氟乙烯（ePTFE）、聚乙烯對酞酸鹽（Dacron）制成的血管，適用于大直徑高血流速段血管移植，直徑5mm以下的低血流速段血管移植療效差，往往發(fā)生血栓栓塞。4 、組織工程化血管,三、組織工程化血管（一）血液與植入材料之間的反應(yīng)1．蛋白吸附 一旦血液通過移植物，血漿蛋白（白蛋白、纖維蛋白、免疫球蛋白IgG等）立即吸附于移植物血管壁。在移植物表面發(fā)生重新分布。 2．血

7、小板沉積 蛋白質(zhì)/血小板復(fù)合物沉積后血小板構(gòu)象發(fā)生改變并釋放顆粒，釋放出一系列生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)可激活其他血小板并增加凝血酶的產(chǎn)生；誘導(dǎo)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞漂移和增殖；控制單核細(xì)胞積聚到移植物上。,3．中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤 趨化因子將中性粒細(xì)胞吸引到移植體上，被激活的中性粒細(xì)胞釋放出氧、自由基和各種酶，誘導(dǎo)基質(zhì)降解，控制整個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞分化的過程，控制移植血管的組織整合。4．內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的向內(nèi)生長 移植物

8、僅有有限的內(nèi)皮細(xì)胞向內(nèi)生長，其生長不超過吻合端l～2 cm；吻合口區(qū)周圍可以發(fā)現(xiàn)受損傷或未融合的內(nèi)皮細(xì)胞，但生化性質(zhì)發(fā)生改變，可能啟動(dòng)血栓形成和平滑肌細(xì)胞生長。平滑肌細(xì)胞增殖，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分。這種平滑肌細(xì)胞過度增生的反應(yīng)通常被認(rèn)為是產(chǎn)生內(nèi)膜肥厚的主要原因。,（二）移植物的組成和構(gòu)建1、多孔性和通透性 組織向內(nèi)生長的速度依賴于移植物的多孔性和通透性。通透性過小影響移植體內(nèi)皮化的速度，增加血栓形成；通透性過大，使周圍組織長入

9、過快而阻塞移植血管。2、血管壁順應(yīng)性 在順應(yīng)性相對較好的動(dòng)脈和不可延展的移植物吻合口處是出現(xiàn)血流紊亂的部位；動(dòng)脈不同區(qū)域順應(yīng)性變異性太大——遠(yuǎn)端小腔隙動(dòng)脈順應(yīng)性小于較大的、較中心的動(dòng)脈。3、流動(dòng)面特性 血液與移植體表面的相互作用，依賴于其表面的理化特性。如表面電荷、粗糙程度。,(三)移植物的喪失和通暢率 即刻喪失--機(jī)械原因 置人體內(nèi)第1個(gè)月發(fā)生喪失--遠(yuǎn)端高阻力發(fā)生血栓所致。 置入后6個(gè)月到3年發(fā)生喪失--吻合

10、口假性內(nèi)膜過度增生。 可以通過預(yù)先處置移植物的構(gòu)建、組成和／或通過誘導(dǎo)改變血液和組織對植入移植物反應(yīng)等干預(yù)措施來消除這些障礙。,四、生物雜交移植物(一)表面改性1、中性多聚體外衣：中性碳衣、硅衣2、蛋白涂層：明膠、膠原3、抗生素浸漬移植物：頭孢菌素、利福平4、抗凝劑的附著：尿激酶（二）內(nèi)皮化移植物1、內(nèi)皮細(xì)胞種植－外源性內(nèi)皮細(xì)胞的應(yīng)用 問題：細(xì)胞的密度；細(xì)胞的黏附和駐留 解決：含氮血漿處理移植體；延長孵育

11、時(shí)間； 選擇利于細(xì)胞吸附的材料 2、刺激內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞再表面化：FGF,（三）生物可吸收材料血管移植物的應(yīng)用： 不余留可能殘余細(xì)菌孳生的材料、降低感染 不余留長期異物炎癥反應(yīng)的材料； 減少內(nèi)膜過度增厚、減少血管阻塞建立完整、有效、有力的組織結(jié)構(gòu)： 1、可吸收材料中混合使用非可吸收材料 2、使用兩種或兩種以上的不同組織降解率的可吸收材料 3、應(yīng)用生長和趨化因子，加強(qiáng)

12、組織向內(nèi)生長，加強(qiáng)加快 細(xì)胞整合到移植體上,五、血管組織工程：（一）體外血管組織工程：周期長 膠原支架—內(nèi)皮細(xì)胞－平滑肌細(xì)胞－成纖維細(xì)胞 （二）體內(nèi)血管組織工程： 1、無細(xì)胞管狀基質(zhì)+bFGF 2、小腸黏膜下層（SIS）血管替代品 3、小腸膠原層（ICL）血管替代品,第八節(jié) 神經(jīng)組織工程,一、周圍神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、神經(jīng)纖維 神經(jīng)纖維是由神經(jīng)元的軸突和包繞軸突的鞘膜所組成。

13、鞘膜主要由雪旺細(xì)胞組成。軸突是神經(jīng)元上最長的突起。軸突內(nèi)含有神經(jīng)微絲、神經(jīng)微管、線粒體、粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。2、神經(jīng)纖維的分類3、結(jié)締組織膜 神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)束膜、神經(jīng)外膜,,二、周圍神經(jīng)損傷的再生機(jī)制,神經(jīng)受損后再生的條件：①神經(jīng)的細(xì)胞體必須得到保護(hù)，防止不可逆損傷的發(fā)生，并維持可生長的狀態(tài)；②再生的神經(jīng)元突起能受到刺激而延伸，并通過引導(dǎo)作用穿越損傷部位；③軸突前端的生長錐能夠?qū)ふ液妥R別到相應(yīng)的靶器官，建立起新的有功能的突觸

14、。,（一）周圍神經(jīng)損傷后的病理生理改變：遠(yuǎn)側(cè)斷端：Wallerian變性。軸突降解，髓鞘潰變、裂解，巨噬細(xì)胞吞噬潰變髓鞘，雪旺細(xì)胞分裂、增殖近側(cè)斷端：軸漿運(yùn)輸繼續(xù)進(jìn)行，近端腫脹和回縮，軸膜封閉斷端，更多細(xì)胞器聚集形成回縮球神經(jīng)元：（軸突反應(yīng)：神經(jīng)元胞體腫脹，尼氏體融解或消失，神經(jīng)元死亡。 ） 反應(yīng)程度與受損軸突的部位與胞體之間的距離和損傷程度相關(guān)。,（二）神經(jīng)纖維的再生：1、終末再生 損傷近斷端軸突回縮，逐漸腫脹。

15、幾天后開始活躍增長出現(xiàn)生長椎。生長椎發(fā)出細(xì)小軸絲，在各個(gè)方向向外生長。 損傷遠(yuǎn)斷端wallerian變性，軸突降解，髓鞘崩潰，雪旺細(xì)胞增殖（正常4－17倍），形成Bungner帶。 Bungner帶：雪旺細(xì)胞沿基底膜縱向排列，相互結(jié)合－有序的、柱狀排列結(jié)構(gòu),2、側(cè)支再生： 鄰近未損傷軸突受雪旺細(xì)胞分泌因子及相應(yīng)微環(huán)境誘導(dǎo)，生長出新的軸突側(cè)支新芽 伸入Bungner帶生長延伸到達(dá)效應(yīng)器官,（三）神經(jīng)元的

16、保護(hù)與神經(jīng)再生： 神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF、bFGF） ECM成分（層粘連蛋白LN）、雪旺細(xì)胞 NGF：促神經(jīng)細(xì)胞存活率增高 促神經(jīng)細(xì)胞伸出的突起延伸 體外培養(yǎng)的神經(jīng)元，誘導(dǎo)突起向NGF濃度高的 地方生長，決定神經(jīng)纖維生長方向——趨化性,三、雪旺細(xì)胞在神經(jīng)再生中的作用1、雪旺細(xì)胞對神經(jīng)元的保護(hù)作用： 分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)和ECM2、神經(jīng)損傷

17、后雪旺細(xì)胞的變化： 潰變軸突、髓鞘刺激雪旺細(xì)胞分裂、增殖形成Bungner帶 再生軸突刺激雪旺細(xì)胞分裂、增殖,3、雪旺細(xì)胞的營養(yǎng)作用： 分泌NGF、FGF等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,4、雪旺細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì): LN、FN、I和IV型膠原、硫酸肝素蛋白5、雪旺細(xì)胞分泌的細(xì)胞粘附分子,調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)軸突生長 細(xì)胞間粘附分子、血管細(xì)胞粘附分子、 髓鞘相關(guān)糖蛋白、周圍髓鞘蛋白,四、神經(jīng)損傷的修復(fù)： （

18、一）直接縫合：外膜縫合、束膜縫合 不能直接縫合：神經(jīng)回縮、神經(jīng)缺損、 直接縫合后存在張力 （二）自體神經(jīng)移植： 皮神經(jīng)：有足夠的長度和外徑 解剖部位恒定且表淺易于尋找 切取后供區(qū)感覺障礙較少 缺損多少、受區(qū)組織條件影響移植效果,（三）同種異體神經(jīng)移植：缺損過長或粗大神經(jīng)缺損 液氮低溫冷凍 降低

19、抗原性（四）自身非神經(jīng)材料：動(dòng)脈、靜脈、筋膜、骨骼?。ㄎ澹┤斯ず铣刹牧希汗枘z管、PGA、膠原、PLA,周圍神經(jīng)理想的修復(fù)材料應(yīng)具備以下條件：①能通過正常的生理途徑被完全降解吸收，以免在 神經(jīng)生成后對其形成壓迫和影響物質(zhì)交換。②吸收速度和神經(jīng)纖維再生速度相一致，能為軸突 再生提供一個(gè)支持而通過缺損部位。③能誘導(dǎo)和促進(jìn)軸突生長。④無毒性、無抗原性和無致腫瘤性。⑤良好的物理性能，在神經(jīng)生長時(shí)提供支持，避免 壓迫神

20、經(jīng)。⑥具有良好的滲透性，利于物質(zhì)交換。⑦易于加工制作成適合不同神經(jīng)缺損要求的形狀和 長度的材料。,五、組織工程方法修復(fù)神經(jīng)損傷（一）導(dǎo)管和支架的研究： 1、操作簡單； 2、無張力或張力小 3、防止瘢痕生成； 4、對軸突生長起導(dǎo)向作用 5、使內(nèi)源性神經(jīng)活性物質(zhì)聚集， 同時(shí)排除外源性抑制分子 聚乙烯、丙烯酸共聚物、膠原、硅膠管 層粘連蛋白和黏多糖,（二）細(xì)胞外基質(zhì)的應(yīng)用：

21、 ECM類似物： 細(xì)胞－細(xì)胞間的連接；細(xì)胞分化的導(dǎo)向作用 分子量小的、可溶性的、生物活性成分,（三）種子細(xì)胞與移植 雪旺細(xì)胞培養(yǎng)： 1）植塊反復(fù)接種法： 種植塊必須緊貼到培養(yǎng)器上，不能懸浮 可獲得大量純凈的雪旺細(xì)胞而不用細(xì)胞毒性藥物 周期長 2）酶消化法： 0.25%胰蛋白酶＋0.03%膠原酶分次消化,培養(yǎng)：20％小牛血清DMEM——24h加入阿

22、糖胞苷 ——24h換為正常培養(yǎng)液——24h加入阿糖胞苷 ——24h改為正常培養(yǎng)液操作簡單，周期短；應(yīng)用細(xì)胞毒性藥物，雪旺細(xì)胞純度稍低3、差速貼壁法：預(yù)涂多聚賴氨酸，30－60分鐘,PLA中空纖維管復(fù)合ECM、雪旺細(xì)胞橋接大鼠坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后3個(gè)月，神經(jīng)通過橋接體,PLA復(fù)合ECM、雪旺細(xì)胞，術(shù)后6周再生神經(jīng)生長椎,PLA復(fù)合ECM、雪旺細(xì)胞，術(shù)后3個(gè)月橋接體內(nèi)神經(jīng)纖維生長良好,雪旺細(xì)

23、胞經(jīng)標(biāo)記后植入PLA，橋接鼠坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后6周，大量雪旺細(xì)胞存活,六、周圍神經(jīng)組織工程展望1、雪旺細(xì)胞： 培養(yǎng)永生化SC 基因工程技術(shù)修飾SC，保留應(yīng)有的功能2、支架材料：半透膜、中空纖維管、 生物多孔材料攜帶種子細(xì)胞3、ECM：膠原、LN、FN 生物凝膠：含LN、FN等多種ECM成分,PLA無紡纖維布與ECM、雪旺細(xì)胞復(fù)