綿羊肺炎支原體GlpO FAD結(jié)合位點(diǎn)的驗(yàn)證及該位點(diǎn)不同Gly對(duì)其活性的影響.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引發(fā)綿羊傳染性胸膜肺炎的主要致病菌。課題組前期對(duì)綿羊肺炎支原體Y98株甘油3-磷酸氧化酶(glycerol3-phosphate oxidase，GlpO)的研究發(fā)現(xiàn)，其編碼基因全長(zhǎng)1，134bp，編碼377個(gè)氨基酸;并證明了該蛋白位于細(xì)胞膜上，且能夠催化底物甘油3-磷酸生成DHAP及H2O2。
　　研究認(rèn)為，GlpO是以CH-OH基團(tuán)為供體的氧化還原酶類，

2、為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴型氧化酶。GlpO是肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）、絲狀支原體絲狀亞種SC型（Mycoplasma mycoides subsp.mycoides SC）標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1、雞敗血支原體（Mycoplasmagallisepticum）等支原體致病的毒力因子之一，主要參與甘油代謝途徑，可氧化甘油3-磷酸(glycerol3-phosphate，G3P)產(chǎn)生H2O2，引起炎癥反應(yīng)

3、導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　　氨基酸序列同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Y98株GlpO與SC型標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1的GlpO、肺炎支原體的GlpD相似性分別達(dá)到64％、62％，且在其第15-20位的氨基酸也存在一個(gè)可能的FAD結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域Gly15-Ala16-Gly17-Ile18Ile19-Gly20。在對(duì)FAD結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)研究認(rèn)為，Gly對(duì)維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其識(shí)別起著關(guān)鍵作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用PCR擴(kuò)增方法獲得了MO GlpO可能的FAD結(jié)合位點(diǎn)的缺失

4、突變體及該位點(diǎn)上Gly15、Gly17、Gly20的單個(gè)Gly缺失突變體，對(duì)MO GlpO FAD結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，不同位點(diǎn)Gly對(duì)其活性的影響進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:
　?、倮脤?shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pET28a-glpO載體為模板，采用大引物PCR法獲得glpO FAD結(jié)合位點(diǎn)缺失突變體glO△FAD片段，并將其連接至pET32a表達(dá)載體;以pET32a-glpO為模板，通過(guò)一步反向PCR法獲得三種FAD結(jié)合位點(diǎn)單個(gè)Gly缺失突

5、變體pEg△G15、pEg△G17、pEg△G20。
　　②將四種GlpO突變體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)，目的蛋白均以包涵體形式存在，大小約為60 kD。利用6M尿素將包涵體蛋白溶解，設(shè)定4M、2M、0M尿素梯度對(duì)突變體蛋白及課題組前期表達(dá)的GlpO蛋白進(jìn)行處理，成功獲得復(fù)性后GlpO及其突變體重組蛋白。
　?、垡詮?fù)性后GlpO蛋白為對(duì)照，檢測(cè)

6、突變體蛋白的氧化酶活性。發(fā)現(xiàn)體外條件下，加入FAD時(shí)，GlpO蛋白具有氧化酶活性，能夠以甘油3-磷酸為底物催化產(chǎn)生H2O2，不加入FAD時(shí)無(wú)H2O2產(chǎn)生;而無(wú)論是否加入FAD，GlpO整個(gè)FAD結(jié)合位點(diǎn)缺失及單個(gè)Gly缺失突變體重組蛋白都不能催化甘油3-磷酸產(chǎn)生H2O2，不具有氧化酶活性。驗(yàn)證了Gly15-Ala16-Gly17-Ile18-Ile19-Gly20確為GlpO的FAD結(jié)合位點(diǎn)序列，且Gly15、Gly17、Gly20對(duì)該

7、位點(diǎn)與FAD的結(jié)合起著關(guān)鍵作用。
　?、軐O、GlpO及四種GlpO突變體蛋白分別作用于小鼠肺臟上皮TC-1細(xì)胞，經(jīng)MTT和ROS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否添加甘油，F(xiàn)AD結(jié)合位點(diǎn)缺失突變體及該位點(diǎn)的三種單個(gè)Gly缺失突變體重組蛋白都不能引起細(xì)胞產(chǎn)生ROS，均對(duì)細(xì)胞的存活率無(wú)明顯影響。表明FAD結(jié)合位點(diǎn)6個(gè)氨基酸缺失或該位點(diǎn)單個(gè)Gly缺失都會(huì)使GlpO失去酶活性。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建四種GlpO缺失突變體，在蛋白水平、細(xì)胞水平對(duì)其