野生型MxA蛋白及其突變體抑制HBV復制活性研究.pdf

1、研究背景： MxA蛋白由662個氨基酸殘基組成，是大GTP酶蛋白超家族成員和動力素超家族成員，分子量為76KD。MxA蛋白有GTP酶活性，即該蛋白有結合GTP的活性和水解GTP能力。MxA蛋白通過N端氨基酸GTP結合元件結合外源性GTP；C端氨基酸含有GTP酶水解效應區(qū)，能夠將內源或外源GTP降解為GDP。 研究目的： 1、研究MxA蛋白在HepG2細胞中抑制HBV復制活性。 2、E645R變異是否影響M

2、xA蛋白抑制HBV復制活性。 3、GTP酶活性是否是影響MxA蛋白抑制HBV復制的關鍵因素。 4、MxA蛋白是否主要抑制HBV的核內復制階段。 研究方法： 1、野生型和GTPase缺陷型MxA蛋白表達載體的鑒定：pcDNA3.1-Flag-MxA(wild-type)，pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A，pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612

3、K重組載體轉化DH5a，挑選陽性克隆，經過PCR鑒定和雙酶切鑒定后進一步測序鑒定；測序結果與pubmed公布序列通過DNAsis軟件比對。用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)中量抽提以上各質粒和空質粒pcDNA3.1(+)。 2、野生型MxA蛋白抑制HBV復制活性研究：用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)大量抽提重組質粒pU19-1.24HBV。常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細胞。按5×1

4、06細胞/皿將細胞接種到直徑10cm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時細胞貼壁后待轉染。 3、檢測Flag-MxA蛋白抑制HBV過程中是否發(fā)生降解：實驗組取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重組質粒分別為10μg和5μg共轉染；對照組取pcDNA3.1-Flag-MxA重組質粒10μg，pU19質粒和SalmonDNA共5μg共轉染HepG2細胞，兩組pSeap質粒均取0.3μg，轉染3天后，收集細胞裂解，蛋白定

5、量后westernblot檢測細胞內Flag-MxA蛋白表達水平。 4、檢測Flag-MxA蛋白抑制HBV過程中是否發(fā)生重新分布：實驗組取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重組質粒分別為10μg和5μg共轉染HepG2細胞；對照組取pcDNA3.1-Flag-MxA重組質粒10μg，pU19質粒和SalmonDNA共5μg共轉染HepG2細胞，3天后取出載玻片，常規(guī)方法使用anti-Flag單克隆抗體染

6、Flag-MxA蛋白，HO33342染細胞核，激光共聚焦觀察Flag-MxA蛋白在細胞核內外分布。 5、E645R變異MxA重組載體(pcDNA3.1-Flag-MxAE645R)構建：我們在pcDNA3.1-Flag-MxA重組質?；A上采用定點突變獲得pcDNA3.1-Flag-MxAE645R重組質粒。 6、E645R變異MxA蛋白抑制HBV復制活性研究：常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細胞接種到直徑10cm細胞培養(yǎng)皿中，培

7、養(yǎng)24小時細胞貼壁后待轉染。 7、GTP酶缺陷型MxA變異體對HBV復制的影響：常規(guī)方法培養(yǎng)HepG2細胞接種到直徑10cm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時細胞貼壁后待轉染。 8、野生型MxA蛋白和T103A變異蛋白的核內表達型重組載體(pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103)的構建：pcDNA3.1-HA-MxA(wild-type)和pcDNA3.1-HA-MxA(T103A)兩種載體轉化DH5

8、α，挑選陽性克隆，經過PCR和雙酶切鑒定后進一步測序鑒定。測序結果與pubmed公布序列通過DNAsis軟件比對。 9、MxA蛋白核內表達型抑制HBV復制研究：pcDNA3.1-HA-MxA(wild-type)和pcDNA3.1-HA-MxA(T103A)與各自核內表達型載體(pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103)使用HiSpeedPlasmidMidiKit提取質粒。 結果： 1

9、、MxA表達載體鑒定：pcDNA3.1-Flag-MxA(wild-type)，pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A，pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612K重組載體經酶切和測序鑒定并與PUBMED公布的人MxA序列比對表明各載體序列正確。定點突變獲得的pcDNA3.1-Flag-MxAE645R載體經測序序列正確。pcDNA3.1-HA-MxAandpcDNA3.1-HA-

10、T103A經酶切和測序表明序列正確；核內表達型載體pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103測序結果也表明正確插入了SV40大T抗原核內轉移信號肽。 2、野生型MxA蛋白抑制HBV復制結果：Westernblot檢測pcDNA3.1-Flag-MxA重組質粒和pU19-1.24HBV重組質粒按1:1、2:1共轉染HepG2細胞時，按2:1比例共轉染時MxA蛋白表達較1:1時強。與對照組相比，按1:1比例轉

11、染時MxA組HBeAg下降27％，HBsAg與對照組差別沒有顯著性意義(P>0.05)。轉染比例按2:1比例轉染時MxA組的HBeAg較對照組下降65％，差別有顯著性意義(P<0.01)；HBsAg與對照組下降21％(P<0.05)。各組上清進行real-timePCR檢測顯示1:1轉染時MxA組較對照組上清HBVDNA水平分別下降1.05個log10值，細胞內HBVDNA下降0.68個log10值。2:1轉染時MxA組較對照組上清HB

12、VDNA水平下降1.91個log10值，細胞內HBVDNA下降1.69個log10值。 3、抑制HBV復制時MxA蛋白的表達和分布：Westernblot檢測結果顯示MxA蛋白抑制HBV組與對照組MxA蛋白表達沒有明顯差別；激光共聚焦顯微鏡顯示在沒有HBV復制的HepG2細胞中Flag-MxA蛋白主要分布于細胞漿，而在HBV復制的HepG2細胞中Flag-MxA蛋白部分發(fā)生了核內移。 4、MxA蛋白E645R變異載體抑制

13、HBV復制：Westernblot檢測結果表明MxA組和E645R組有較好的Flag-MxA蛋白表達；MxA組和E645R組上清進行abbott檢測顯示MxA組和E645R組HBsAg較對照組分別下降21％和24％；HBeAg分別下降65％和59％，差異具有顯著意義(P<0.01)。MxA組和E645R組間HBsAg和HBeAg表達水平差異沒有顯著性意義(P>0.05)。各組進行realtimePCR檢測顯示MxA組和E645R組較對照

14、組上清HBVDNA水平分別下降1.91個和2.22個log10值，細胞內HBVDNA分別下降下降1.69和1.70個log10值。 5、GTPase活性缺陷型載體對HBV復制的抑制：Westernblot結果顯示各組MxA蛋白均有較好的表達，對照無表達。與對照組相比，上清中的HBeAg在野生型組、K83A、T103A和L612K變異組的表達分別下降73％，71％，73％和70％(P<0.01)；上清的HBsAg水平在野生型組、K

15、83A、T103A和L612K變異組的表達分別下降41％，41％，44％和41％(P<0.01)；上清HBVDNA水平分別下降2.22，2.11，2.23和2.18log10(P<0.01)，細胞內HBVDNA水平下降1.89，1.78，1.72和1.93log10(P<0.01)。在K83A、T103A和L612K變異組上清HBVDNA水平、HBsAg和HBeAg水平和細胞內的HBVDNA水平與野生型組比較差異沒有顯著性意義(P>0.

16、05)。 6、TMXA和T103抑制HBV復制的結果：Westernblot結果顯示各組均有較好的HA-MxA蛋白表達。激光共聚焦結果顯示在轉染TMxA和T103載體的HepG2細胞中，MxA蛋白主要以細胞核內表達為主；而胞漿型MxA載體和T103A載體在抑制HBV過程中僅部分核內移，說明我們的核內表達型載體提高TMxA的核內表達濃度。與對照組相比，在MxA，TMxA,103和T103組，細胞外HBeAg水平下降28％，9％，2

17、8％和10％；細胞外HBVDNA水平分別下降88％，44％，88％和39％；細胞內HBVDNA分別下降81％，350/o，76％和42％。TMxA和T103組細胞外HBeAg水平和胞內胞外HBVDNA水平均顯著低于對照組(P<0.01)，但分別顯著高于MxA和103組的水平(P<0.01)。 結論： 1、MxA蛋白在HepG2細胞中抑制HBV復制；E645R變異不影響MxA蛋白抑制HBV復制活性。 2、MxA在抑